靶向人DcR3的microRNA表达载体的构建

周健 何宋兵 宋世铎 朱东明 李德春 张子祥

·短篇论著·

靶向人DcR3的microRNA表达载体的构建

周健 何宋兵 宋世铎 朱东明 李德春 张子祥

诱骗受体3(decoy receptor ,DcR3)属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员，是一种凋亡抑制蛋白[1]。有研究发现，DcR3基因的表达与人类多种恶性肿瘤的发生、发展及肿瘤免疫逃逸密切相关[2-3]。microRNA(miRNA)干扰技术以其高效、特异的优势，已经成为一种有效的基因沉默工具。我们前期的实验研究表明，DcR3基因在人胰腺癌组织和外周血中高表达，并抑制肿瘤细胞凋亡[4]。本研究构建靶向DcR3基因的miRNA表达载体，为胰腺癌的基因治疗提供一个新的靶点。

一、材料与方法

1．靶向DcR3的miRNA表达质粒的构建：根据GenBank中DcR3的基因序列(NM_003823)，设计2个靶向DcR3的miRNA。 DcR3-miRNA-1模板包括正义链5′-GTCATC-GACTTTGTGGCTTTC-3′，反义链5′-GAAAGCCACAAAGTC-GATGACG-3′，loop区5′-AGTGAAGCCACAGATGTA-3′；DcR3-miRNA-2模板包括正义链5′-TACACGCAGTTCTGGAACTAC-3′，反义链5′-TACACGCAGTTCTGGAACTAC-3′，loop区5′-AGTGAAGCCACAGATGTA-3′。2个DcR3-miRNA及阴性对照miRNA(shRNA-C)设计及合成均由上海Genechem公司完成。将两条模板单链退火形成双链，插入经Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后形成的线性化质粒载体pP-EGFP-miRNA，形成重组质粒pP-EGFP-DcR3-miRNA-1、pP-EGFP-DcR3-miRNA-2。将连接产物转化入感受态E.coli TOP10细菌，在含有壮观霉素的LB琼脂糖培养基中培养16 h。挑取阳性克隆，小量提取质粒，经Xho Ⅰ和EcoRⅠ双酶切后电泳分离鉴定质粒，并送上海生工生物技术有限公司测序。测序正确的2个重组质粒分别命名为DcR3-miRNA-1、DcR3-miRNA-2

2．质粒转染PANC1细胞：人胰腺癌细胞株PANC1细胞为本实验室保存，常规培养。取对数生长期的PANC1细胞接种于12孔培养板，每孔1×105细胞，分成空白对照组、阴性质粒对照组、DcR3-miRNA-1组和DcR3-miRNA-2组。培养16 h后采用脂质体Lipofectnmine 2000将相应质粒分别转染细胞，继续培养24 h，在荧光显微镜下观察EGFP表达情况。

3．转染细胞DcR3 mRNA表达的检测： 采用Trizol提取各组细胞总RNA，逆转录合成cDNA。DcR3探针5′-FAMCTCCTCAGCTCCTGGTACCCTTAMRA-3′，上游引物5′-CTC-TTCCTCCCATGACAC-3′，下游引物5′-CTGGAAAGCCAC-AAAGTC-3′，产物112 bp；内参β-actin探针5′-FAMTTG-AGACCTTCAACACCCCAGCCTAMRA-3′，上游引物5′-CGTGAAAAGATGACCCAGATCA-3′，下游引物5′-CAGCCTGGA-TGGCTACGTACA-3′，产物96 bp。DcR3的定量采用Taq酶探针法，PCR扩增条件：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 1 min，共40个循环，72℃延伸10 min。采用2-ΔΔCt公式计算mRNA表达量(ΔCt=Ct目的基因-Ctactin,ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt阴性对照)。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外线成像、摄影。

4．转染细胞DcR3蛋白表达的检测：收集转染24 h的细胞，提取细胞中的总蛋白，BCA法测蛋白浓度，常规行蛋白质印迹法检测DcR3蛋白表达。鼠抗人DcR3单抗购自Abcom公司，工作浓度1∶300。最后ECL显影，凝胶成像系统成像和扫描分析，以GAPDH蛋白作为内参。

二、结果

1．重组质粒鉴定及测序：重组质粒DcR3-miRNA-1和DcR3-miRNA-2双酶切后经琼脂糖凝胶电泳显示约400 bp左右条带，与预期值416 bp一致。空白对照未见条带，阴性对照质粒见约1215 bp条带(图1)。测序结果表明重组质粒序列与所设计的基因序列完全相符(图2)。

1：空白对照；2：阴性对照质粒；M：Marker；3～4：DcR3-miRNA-1；5～6：DcR3-miRNA-2

图1重组质粒的酶切鉴定电泳图

图2 重组质粒的测序图

2．重组质粒转染PANC1细胞：pP-EGFP质粒带有绿色荧光蛋白(GFP)，重组质粒转染PANC1细胞后，阴性质粒对照转染细胞、重组质粒DcR3-miRNA-1、DcR3-miRNA-2转染细胞均有绿色荧光蛋白表达，约占细胞总数的80%，空白对照细胞未见绿色荧光(图3)。

a：空白对照；b：阴性对照质粒；c：DcR3-miRNA-1；d：DcR3-miRNA-2

3． 转染细胞DcR3 mRNA的表达：2个转染重组质粒细胞的DcR3 mRNA表达均较转染阴性对照质粒的细胞及空白对照细胞明显下降(P﹤0.01)，2个转染重组质粒细胞的DcR3 mRNA表达的差异无统计学意义(P﹥0.05)。扩增产物电泳后均可在112 bp及96 bp对应位置见清晰的条带，与预期相符，但转染重组质粒2组的条带较浅(图4)。

4．转染细胞DcR3蛋白的表达：2个转染重组质粒细胞的DcR3蛋白表达均较转染阴性对照质粒的细胞及空白对照细胞明显下降(P﹤0.05) ，其中转染DcR3-shRNA-2细胞的抑制效果更明显，抑制率为76.8%(图5)。

讨论DcR3又称TR6或M68，是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员，DcR3与肿瘤坏死因子家族中的骨保护素(OPG)、TNFR2、Fas分别具有31%、29%和17%的序列同源性[5]。DcR3具有抑制凋亡和促进肿瘤细胞免疫逃逸的双重功能，能竞争性结合Fas配体(FasL)、肿瘤坏死因子样配体1A(TL1A)和T细胞上可诱导表达的、与单纯疱疹病毒糖蛋白D竞争结合单纯疱疹病毒侵入介体的淋巴毒素类似物(LIGHT)，从而阻断它们所介导的细胞凋亡[6-8]。此外，DcR3在T细胞和DC细胞的免疫调节方面也发挥着重要的作用[9-10]。在多种人类恶性肿瘤如胃癌、结肠癌、食道癌、肺癌、肝癌中均能检测出DcR3的高表达[5,11-14]。因此，DcR3可以作为肿瘤基因治疗的良好靶点。

与空白对照组和阴性对照组比较，aP<0.01

与空白对照组和阴性对照组比较，aP<0.05

RNA干扰(RNAi)已被证明是一种强大而有效的实验工具，通过与靶基因结合沉默目的基因的表达。RNAi主要包括两类，即siRNA和miRNA。miRNA是继siRNA之后研究较为深入的又一类长20～24 nt的小分子非编码RNA，它广泛存在于真核生物中，不具有开放阅读框架，不编码蛋白质，具有高度保守性、基因表达时序性和组织特异性[15-16]。miRNA调控靶基因方式有3种：(1)miRNA与目的基因完全互补结合，作用方式及功能与siRNA非常相似，切割和降解mRNA[17]。(2)miRNA与目的基因不完全互补，抑制蛋白质翻译而不影响mRNA稳定[18]。(3)miRNA诱导目的基因快速脱腺苷化，从而导致mRNA的表达水平下降[19]。因此，miRNA在精准调控基因上可能有着非常重要的作用。

在miRNA的加工过程中，影响Drosha酶剪切的因素为其二级结构，与miRNA一级序列无关，这为通过替换天然的miRNA的靶序列、构建靶向特定靶点的人工miRNA提供重要的理论依据[20]。本研究中我们针对人DcR3的基因序列，设计靶向DcR3的两条miRNA序列， 5′及3′侧翼区来源于miRNA30转录本，反向互补的21 nt转录后形成靶向mRNA的核心序列，两端设计的非互补的黏性末端与线性化质粒连接，避免连接方向错误等问题，并通过BLAST对其进行特异性分析，确认与人类其他基因无同源序列。使用的干扰载体为pP-EGFP-miR质粒，是特殊设计的表达miRNA并且含有miR侧翼的序列，该质粒含有PolⅡ启动子，是一种人的巨细胞病毒早期启动子，可高水平表达miRNA，在大多数哺乳动物细胞中表达，并且可以使用组织特异性诱导型启动子，从而有利于脱靶效应的控制。

本实验设计并构建了靶向DcR3的miRNA表达载体，经电泳及测序证实载体构建成功，应用Lipofectamine 2000转染胰腺癌PANC1细胞，通过RT-PCR和蛋白质印迹法验证针对DcR3的抑制效率，发现两个重组质粒均能在mRNA和蛋白水平抑制胰腺癌PANC1细胞DcR3的表达，且DcR3-miRNA-2的干扰效果更佳，证实了该质粒可用于靶向DcR3的胰腺癌基因治疗的研究。

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2012-11-14)

(本文编辑：吕芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.02.016

国家自然科学青年科学基金项目(81201905)；江苏省普通高校研究生科研创新计划( CXLX11_0088)

215000 苏州，苏州大学附属第一医院普外科

张子祥，Email：skysuzhou0612@gmail.com