靶向B7-H3基因RNA干扰慢病毒的构建及人胰腺癌PaTu8988稳定感染细胞株的建立

赵鑫 张光波 李智 干文娟 朱东明 赵华 张子祥 李德春

·论著·

靶向B7-H3基因RNA干扰慢病毒的构建及人胰腺癌PaTu8988稳定感染细胞株的建立

赵鑫 张光波 李智 干文娟 朱东明 赵华 张子祥 李德春

目的构建靶向人B7同源性3(B7-H3)基因的小发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体，并建立稳定感染的胰腺癌PaTu8988细胞株。方法根据GenBank提供的B7-H3 cDNA序列，设计4条靶向B7-H3的siRNA序列，构建重组干扰质粒pGCSIL-GFP-B7-H3-shRNA。将重组干扰质粒和过表达B7-H3质粒共同转染293T细胞，经蛋白质印迹法筛选出干扰效果最佳的重组干扰质粒。该质粒经慢病毒包装，并感染胰腺癌PaTu8988细胞株，建立稳定低表达B7-H3细胞株。应用实时定量PCR及蛋白质印迹法检测细胞B7-H3基因的表达抑制率。结果携带干扰效果最好的shRNA的慢病毒感染PaTu8988细胞，建立了稳定低表达B7-H3基因的PaTu8988细胞株，其B7-H3 mRNA表达的抑制率达96.8%，B7-H3蛋白表达的抑制率达88.1%。结论成功构建了人B7-H3-RNAi的慢病毒载体，并建立了稳定感染的低表达B7-H3基因的PaTu8988细胞株。

胰腺肿瘤； B7-H3； RNA干扰； 慢病毒感染

B7同源性3(B7 Homolog 3, B7-H3)分子是T细胞共刺激分子B7-CD28家族的新成员，在多种恶性肿瘤中高表达，被认为有望成为新的肿瘤标志物和潜在的治疗靶点。为此，我们设计了靶向B7-H3基因的小分子RNA干扰(siRNA)序列，构建表达人B7-H3-shRNA的慢病毒载体，并建立稳定的人胰腺癌PaTu8988感染细胞株。现将结果报道如下。

材料与方法

一、B7-H3干扰序列插入载体pGCSIL-GFP

根据B7-H3(NM_001024736)基因序列设计4条靶向B7-H3的siRNA序列(siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4)，siRNA1：5′-CAGCTGACAGATACC-AAACAG-3′；siRNA2：5′-CAAAGAAGATGATGGACA-AGA-3′；siRNA3：5′-CTCTGAAACACTCTGACAGCA-3′；siRNA4：5′-GAGCAGGGCTTGTTTGATGTG-3′。据此设计相应互补的单链DNA，按5p向3p顺序依次为：酶切位点(Age I)、siRNA正向序列、Loop环(CTCGAG)、siRNA反向互补序列、终止信号(TTTTT)、酶切位点(EcoR I)。另设计1条用于阴性对照的无关序列siRNA-C，通过BLAST验证该序列对于任何基因无干扰效应。所有小发夹RNA(shRNA)由上海吉凯基因化学公司合成。

应用限制性内切酶Age I和EcoR I双酶切空载体pGCSIL-GFP(上海吉凯基因化学公司)，分别与稀释和退火后的4种shDNA及shRNA-C进行连接，转染用氯化钙制备的新鲜大肠杆菌感受态细胞，涂布加氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养过夜。以不加载体及加空载体为对照。挑取平板上的菌落，使用载体多克隆位点两端的引物进行PCR扩增检测阳性菌落。多克隆位点两端的引物序列为：5′-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3′；5′-GTAATA-CGGTTATCCACGCG-3′。阳性克隆再经测序验证。

二、293T细胞转染

293T细胞(ATCC公司)培养于24孔板，当细胞密度为80%～90%时换成400 μl的Opti-MEM1，分为空白对照组、shRNA-C组、shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组、shRNA4组。空白对照组为单纯293T细胞组，其他各组采用脂质体方法分别将插入相应shRNA的重组干扰质粒及过表达B7-H3的质粒pEGFP-N1-B7-H3-3FLAG-GFP(上海吉凯基因化学公司)共转染293T细胞，每孔加过表达载体0.5 μg，重组干扰质粒0.4 μg，Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)2 μl。转染24 h后在荧光显微镜下观测转染效果，36 h后收集细胞，抽提蛋白，采用蛋白质印迹法检测转染细胞Flag蛋白的表达，以GAPDH为内参。蛋白质印迹法试剂盒购自上海生工公司，按说明书操作。鼠抗Flag抗体购自Sigma公司，鼠抗GAPDH抗体、羊抗鼠IgG二抗购自Santa Cruz公司。以此选择干扰效果最佳的shRNA序列。

三、慢病毒重组体的包装

取对数生长期的293T细胞，以1.2×107个细胞的密度接种于15 cm的培养皿，常规培养24 h，当细胞融合达70%～80%时，换无血清培养基培养2 h。在灭菌离心管中加入干扰效果最佳的重组干扰质粒20 μg或shRNA-C阴性对照质粒20 μg，辅助质粒pHelper1.0及pHelper2.0载体各10 μg，加Opti-MEM 混匀，调整总体积为2.5 ml，在室温下温育5 min。在另一试管中加100 μl Lipofectamine 2000及2.4 ml Opti-MEM混匀。将前述两管混合，室温温育20 min，转移至293T细胞的培养皿培养8 h，更换含血清培养基继续培养48 h，收集病毒上清液，于4℃ 4000×g离心10 min，再用直径为0.45的PVDF滤膜过滤后分装，用于病毒滴度测定和细胞感染。

四、慢病毒感染PaTu8988细胞

PaTu8988细胞为本实验室自国外引进并保存，常规培养，以5×104个细胞接种于6孔板内，培养24 h。待细胞融合达30%时分为空白对照组、阴性对照组、干扰组，不加或分别加入1.5×109Tu/ml的相应慢病毒4 μl(MOI:20)及Polybrene感染细胞12 h，弃培养基，加入2 ml含有10% FBS的1640培养基继续培养4 d，观察带荧光的慢病毒感染细胞，流式细胞仪检测感染效率。再经sorting流式细胞仪分选感染细胞后，检测细胞GFP阳性表达率。

五、感染细胞株B7-H3 mRNA和蛋白检测

取上述3组细胞培养72 h，待细胞融合度达90%时收集细胞。按照Trizol法提取细胞总RNA，荧光实时定量PCR法检测B7-H3的表达。B7-H3引物序列上游5′-CTCTGCCTTCTCACCTCTTTG-3′，下游5′-CCTTGAGGGAGGAACTTTATC-3′，扩增长度134 bp；内参GAPDH引物序列上游5′-TGACTT-CAACAGCGACACCCA-3′，下游5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′，扩增长度121 bp。PCR反应条件：95℃ 15 s，95℃ 5 s、60℃ 30 s，45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值，制作熔解曲线。PCR结束后，95℃变性1 min，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合，从55℃开始每4 s增加0.5℃，直到95℃，同时读取吸光值。采用2-ΔΔCt法计算B7-H3 mRNA相对表达量。

取上述3组细胞，应用康成公司的蛋白抽提试剂盒提取各组细胞的总蛋白， BCA法定量蛋白后采用蛋白质印迹法检测B7-H3蛋白，以GAPDH为内参照。鼠抗人B7-H3单抗购自Bio Legend公司。ECL显色、曝光、显影后，采用灰度分析软件半定量计算B7-H3蛋白表达量。

六、统计学处理

结 果

一、重组质粒的鉴定

转染重组质粒的阳性菌落经PCR扩增，均获得343 bp的条带，转染空载体的PCR扩增条带片段为306 bp(图1)。经测序，4个靶向B7-H3基因的shRNA重组质粒的shRNA编码序列与设计的片段完全一致，表明重组干扰质粒构建成功(图2)。

1：阴性对照组；2：空载体组；M：Maker；N：shRNA-C组；3～6：shRNA1、2、3、4组

图1各组阳性菌落的质粒扩增片段

二、最佳干扰质粒的筛选

因293T细胞不表达Flag，而重组B7-H3过表达质粒是将目的基因B7-H3与Flag融合表达的，转染重组干扰质粒的干扰效果通过Flag的表达抑制体现。质粒转染293T细胞24 h后，各组荧光细胞数均在80%以上，36 h后的蛋白质印迹法检测结果显示shRNA4重组干扰质粒的干扰效果最佳(图3)，确定用该干扰质粒进行慢病毒包装。

三、稳定低表达B7-H3的PaTu8988细胞株的建立

重组慢病毒感染PaTu8988细胞，经sorting流式细胞仪分选纯化提高阳转细胞比例，即获稳定低表达B7-H3的PaTu8988细胞株。经流式细胞仪检测，GFP阳性表达率达96.8%(图4)。稳定低表达B7-H3的PaTu8988细胞的B7-H3 mRNA及蛋白表达较shRNA-C组和空白对照组显著下调，mRNA的抑制率达96.8%，蛋白抑制率达88.1%(图5)。

a～d：shRNA1、2、3、4重组的质粒

图3 各组转染细胞的Flag蛋白表达

图4稳定低表达B7-H3的PaTu8988细胞 (a：荧光显微镜 ×200)及其GFP表达(b：流式细胞仪)

图5各组慢病毒感染后PaTu8988细胞的B7-H3蛋白表达

讨 论

T细胞活化除需要T细胞受体转导的第一信号外，还需要协同刺激分子转导的第二信号。B7-H3为新发现的协同刺激分子中的成员，具有正向或负向调控T细胞的作用[1-4]。B7-H3在多种恶性肿瘤细胞中高表达且是患者预后不良的独立因素[5-9]。研究发现，B7-H3在肿瘤中可能作为一种免疫逃逸通路存在，其表达导致T细胞介导的抗肿瘤免疫的下调[10]。也有学者发现，B7-H3高表达促进肿瘤侵润和转移[11-12]。因此推断B7-H3在胰腺癌的发生、发展中也可能发挥着复杂的作用，其机制有待进一步研究。

近年发展起来的RNAi干扰技术具有高效性、稳定性、可传递性、特异性强等优势。而且慢病毒载体不仅具有毒力低、转染效率高、可转染不同时相细胞、能够携带大片段基因的优点，更重要的是能将目的基因整合到宿主细胞染色体中，并在子代中稳定表达，且具有较好的生物安全性[13-14]。本研究先从4个靶向B7-H3基因的shRNA中筛选出干扰效果最佳的shRNA序列，继而构建RNA干扰重组慢病毒感染人胰腺癌细胞株PaTu8988，经流式细胞仪分选，获得了稳定低表达B7-H3的细胞株，B7-H3 mRNA的表达抑制率达96.8%，蛋白表达抑制率达88.1%，为进一步研究B7-H3基因在胰腺癌发病及进展中的作用及其机制提供了实验基础。

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ConstructionofB7H3RNAilentiviralvectorandestablishmentofitsstablyinfectedhumanpancreaticcancerPaTu88cellline

ZHAOXin,ZHANGGuang-bo,LIZhi,GANWen-juan,ZHUDong-ming,ZHAOHua,ZHANGZi-xiang,LIDe-chun.

DepartmentofGeneralSurgery,FirstAffiliatedHospital,SoochowUniversity,Suzhou215006,China

Correspondingauthor：LIDe-chun,Email:dechunli.soochowedu@yahoo.cn

ObjectiveTo construct the B7-H3-RNAi lentiviral vector and establish a stably infected human pancreatic cancer PaTu88 cell line.MethodsAccording to genetic information of B7 H3 cDNA sequence provided by GenBank, 4 siRNA sequence targeting B7-H3 were designed. The corresponding pGCSIL-GFP recombinant plasmids (pGCSIL-GFP-B7-H3-shRNA) were constructed. Then both recombinant interference plasmid and over-expressing B7-H3 plasmid (pEGFP-N1-H3-1FLAG-GFP) were transfected into 293T cells. Western blot was used to detect the recombinant interference plasmid with best effect of interference. Then this plasmid underwent lentiviral packaging and was infected into PaTu8988 cells and a stably low-expression of B7-H3 cell line was established. Real-time quantitative PCR and Western blot were applied to measure the expression inhibition rate of B7-H3.ResultsLentiviral with the best gene silencing effect shRNA was infected into PaTu8988 cell line, and a PaTu8988 cell line, stably low-expressing B7-H3, was established, and the inhibitive rate of B7-H3 mRNA and protein expression were 96.8% and 88.1%, respectively.ConclusionsB7-H3-shRNA lentiviral vector is successively constructed and pancreatic cancer Patu8988 cell line which can stably low-express B7-H3 is established.

Pancreatic neoplasms； B7-H3； RNA interference； Lentivirus infections

2012-10-08)

(本文编辑：吕芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.02.009

国家自然科学基金(81001138)；江苏省普通高校研究生科研创新计划(CXZZ11_0125)；苏州市科技计划(SYS201120)；苏州大学优秀博士学位论文选题立项(2011一般资助-14)

215006 苏州，苏州大学附属第一医院普外科(赵鑫、朱东明、赵华、张子祥、李德春)，介入科(李智)，病理科(干文娟)；临床免疫研究室，江苏省医学重点实验室，江苏省临床免疫研究所(张光波)

李德春，Email: dechunli.soochowedu@yahoo.cn