普伐他汀联合二甲双胍对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响

邓 燕

糖尿病肾病(DN)是糖尿病的一种常见全身性微血管病变并发症，是终末期肾功能衰竭(ESRD)的重要原因之一。DN的病因主要涉及遗传因素、肾脏血流动力学改变、糖代谢异常、细胞因子等因素，其发病机制复杂。其中，高血糖是引起糖尿病肾功能衰竭的最主要因素［1-2］。肾小球系膜细胞(GMC)是肾脏最易被激活的细胞，可被多种免疫反应产物、炎症因子以及非免疫产物激活。因此，当DN患者肾脏发生损坏时，高血糖过度累积，导致肾脏肾小球受损，产生多种免疫反应产物、炎症因子及非免疫产物，激活GMC;GMC同时释放多种炎症介质，细胞外基质大量聚集，进一步损害肾小球;如此恶性循环，导致肾小球硬化［3-4］甚至肾功能衰竭。有研究表明，普伐他汀联合二甲双胍治疗2型糖尿病合并高脂血症能明显改善血糖血脂异常，效果良好，且无严重不良反应发生［5］。本文观察2种药物联用对GMC增殖的影响，为临床治疗DN提供药理依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 肾小球系膜细胞(武汉博士德生物有限公司，批号:HBZY-1)。药品:普伐他汀片(上海三共制药有限公司，规格:20 mg×7片，批号:110615-12);盐酸二甲双胍缓释片(中美上海施贵宝制药有限公司，规格:0.5 g×20片，批号:110823-02)。试剂:D-Hanks溶液及1640营养液(上海研拓生物);胰蛋白酶(1∶250)(武汉禾元生物);胎牛血清(上海劲马生物);乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(广州市鼎盈贸易有限公司);二甲基亚枫(DMSO)及噻唑兰(MTT)(西宝生物)。仪器:CO2培养箱(长沙长锦科技有限公司);微量加样器、超净工作台、电子天平(精准度为0.01 g)、离心机，上海普林斯顿生物科技发展有限公司;Multiskan FC酶标仪(美瑞泰克科技);96孔板细胞培养板(上海研拓生物)。RPMI-1640(Roswell Park Memorial Institute，RPMI，洛斯维公园纪念研究所研发的一类培养基)培养液的配制:取1袋1640粉剂，溶于双蒸水中，称取2 g NaHCO3粉末、2.38 g谷氨酰胺，加入上述1640溶液中，加双蒸水至1 000 mL，再用浓度均为0.1 mol/L的HCl溶液和NaOH溶液调节pH值至6.9，滤菌器过滤后分装置于-20℃保存备用。EDTA-胰蛋白酶溶液的配制:分别称取0.25 g胰蛋白酶粉末、0.04 g EDTA溶于100 mL D-Hank'S液，搅拌混匀，经微孔滤膜过滤除菌，即得0.04%EDTA-0.25%胰蛋白酶溶液，用小青霉素瓶分装保存于-20℃恒温箱备用。

1.2 方法

1.2.1 GMC的传代培养［6］GMC购回即弃去培养液，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，第2天开始取细胞株进行传代培养:吸掉培养液，加1～2 mL EDTA-胰酶消化液，轻摇培养瓶，使所有细胞表面均有消化液。轻轻吹打细胞，吸出消化液和细胞，加入15 mL离心管内，2 000 r/min离心10 min，吸出上清液，加入培养液;再次以2 000 r/min离心10 min，吸出上清液;加入含20%胎牛血清的RPMI-1640培养液。分装2个25 cm2培养瓶，置入饱和湿度、37℃、5%CO2恒温培养箱培养。每3天换1次液并进行传代，共传3～4代。取第4代GMC进行下游操作。

1.2.2 高糖刺激GMC增殖 根据文献报道［7-8］，葡萄糖浓度为0.6 g/L时刺激作用最明显。本试验取上述第4代的细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔200 μL，约含3×104个细胞，细胞贴壁后，使细胞生长同步于对数生长期，保持细胞间具有可比性。设 0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 g/L 5 个葡萄糖组，另设空白组，每组16孔。空白组加入蒸馏水20 μL，各试验组加入对应浓度葡萄糖20 μL。培养板置于饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱内培养，各组分别培养 12、24、48、72 h，终止前 4 h 每孔加入0.5%MTT溶液。培养4 h后，弃去上清，加100 μL DMSO中止培养，轻微震荡10 min使结晶溶解，用酶标仪在波长490 nm下检测吸光度值。

1.2.3 普伐他汀联合二甲双胍对高糖刺激GMC增殖的影响 采用“1.2.2”项下的方法，在葡萄糖0.6 g/L 20 μL刺激结束后，设5组:空白组为未经葡萄糖处理的细胞，加入20 μL蒸馏水;高糖组加入20 μL蒸馏水;大剂量组加入5.3 mg/L普伐他汀和400 mg/L二甲双胍各10 μL;中剂量组加入2.7 mg/L普伐他汀和200 mg/L二甲双胍各10 μL;小剂量组加入 1.3 mg/L普伐他汀和100 mg/L各10 μL。每组18个孔，同步进行，各组在24、48、72 h后分别取出20 μL 加入 0.5%MTT溶液，后续操作同“1.2.2”项。高糖组及药物组在药物干预期间均未再加糖处理。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0软件，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度葡萄糖不同时间点对GMC增殖的影响 在相同培养条件下，空白组细胞在不同时间点细胞生长明显比葡萄糖各组慢(P＜0.05);0.6 g/L组对GMC增殖的刺激作用明显比其他剂量组强(P＜0.05)，见表1。

表1 不同浓度葡萄糖不同时间点对GMC增殖的影响

2.2 普伐他汀联合二甲双胍对高糖刺激的大鼠GMC增殖的影响 在相同培养条件下，高糖组细胞生长速度明显高于空白组(P＜0.05)，表明葡萄糖诱导大鼠GMC细胞增殖模型成功;普伐他汀联合二甲双胍不同剂量组细胞在48、72 h生长速度较高糖组明显减缓(P＜0.05);大剂量组与中剂量组48、72 h生长速度差异无统计学意义(P＞0.05);大剂量组与小剂量24 h生长速度差异无统计学意义(P＞0.05)，而72 h生长速度较小剂量组明显减缓(P＜0.05)，见表2。

表2 普伐他汀联合二甲双胍不同浓度在不同时间点对高糖刺激大鼠GMC的影响

3 讨论

GMC是肾脏血管周围反应活跃的肾小球细胞，具有多种功能，可产生细胞外基质和细胞因子，且可通过吞噬、处理免疫复合物，清除大分子蛋白，保持肾小球滤过膜的通透性。当肾小球受局部因素和体循环而来的介质损伤时，GMC首先受损害［9-10］，因此，GMC是肾小球肾炎病变的关键环节。正常情况下GMC不发生明显增殖，但在高糖等因素作用下，可见GMC及细胞外基质同时发生异常增生，导致肾组织纤维化和硬化。DN以肾脏硬化性病变为主，病理可见毛细血管基底膜增厚，系膜区扩张、基质增多。DN早期，GMC在高糖环境下可代偿性调控葡萄糖的异常代谢，出现细胞肥大，但数目增加不显著。因此，若能有效控制GMC异常增生，对延缓肾脏纤维化、肾小球硬化的发生、发展有重要意义［11］。有报道，高浓度葡萄糖可以促进GMC迅速增殖［12］。本研究通过观察不同浓度葡萄糖对GMC增殖的影响，发现0.6 g/L浓度最佳。然后在同样孵育环境下，以浓度为0.6 g/L的葡萄糖诱导GMC增殖，并观察普伐他汀联用二甲双胍不同剂量对GMC增殖的影响。在两药联合作用下，高糖诱导的GMC在约24 h时增殖放缓，并于48、72 h时增殖速度明显下降，在72 h后高剂量组的GMC增殖速度最慢(与中剂量组比较差异无统计学意义)，但与小剂量组差异有统计学意义(P＜0.05)，提示该剂量对GMC增殖的抑制作用最强。因此，笔者认为普伐他汀与二甲双胍联用具有抑制高糖刺激的大鼠GMC增殖的作用，为临床治疗DN提供了实验依据，但其作用机制尚待后续研究。

［1］陆颖理，吴晖，翟华玲.2型糖尿病高血糖发生机制研究与治疗新视角［J］.中国糖尿病杂志，2010，18(7):481-483.

［2］张敏，姜涛，宋秀霞，等.波动性高血糖与糖尿病肾病关系的研究［J］.山东医药，2010，50(8):71-73.

［3］冯欣，李垚.高糖状态下大鼠肾小球系膜细胞Ang-2、Tie-2、VEGF的变化及氯沙坦对其的影响［J］.实用医学杂志，2011，27(5):742-744.

［4］王志宏，朱爱国，杨晶涵，等.姜黄素对肾小球系膜细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因表达的影响［J］.中国临床医学，2011，18(1):29-31.

［5］肖雪娜.普伐他汀联合应用二甲双胍治疗混合性高脂血症的疗效及安全性临床观察［J］.中国医药导刊，2010，12(10):1741-1742.

［6］钟丹，杨霓芝，赵代鑫.中药复方通脉口服液对肾小球系膜细胞增殖及分泌IL-1β的影响［J］.时珍国医国药，2008，19(1):4-6.

［7］王亚军，孟建国，黄淑凤.芪药消渴胶囊对高糖诱导肾小球系膜细胞增殖的抑制作用［J］.河北中医，2012，34(3):434-436.

［8］魏吉林，李伟，李雪侠.灵芝对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞增殖及细胞周期的影响［J］.中国中西医结合肾病杂志，2008，9(1):61-65.

［9］翟云鹏，庞训雷，程乾，等.银杏叶提取物、卡托普利、缬沙坦单用及合用对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖肥大的影响［J］.徐州医学院学报，2010，30(6):356-358.

［10］彭爽，曹文富，黄姗.依那普利对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖及分泌TGF-β1、LN的影响［J］.世界科技研究与发展，2010，32(6):850-852.

［11］孙影，张雪鹏，张健，等.益肾蠲湿合剂对肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质分泌的影响［J］.中国医药，2010，5(1):16-18.

［12］陈立军，汪宁.生脉注射液对高糖和糖化终末产物诱导的肾小球系膜细胞增殖的影响［J］.南京中医药大学学报，2010，26(6):15-18.