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普伐他汀联合二甲双胍对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响

2013-10-16

实用药物与临床 2013年10期
关键词:普伐他汀系膜高糖

邓 燕

糖尿病肾病(DN)是糖尿病的一种常见全身性微血管病变并发症,是终末期肾功能衰竭(ESRD)的重要原因之一。DN的病因主要涉及遗传因素、肾脏血流动力学改变、糖代谢异常、细胞因子等因素,其发病机制复杂。其中,高血糖是引起糖尿病肾功能衰竭的最主要因素[1-2]。肾小球系膜细胞(GMC)是肾脏最易被激活的细胞,可被多种免疫反应产物、炎症因子以及非免疫产物激活。因此,当DN患者肾脏发生损坏时,高血糖过度累积,导致肾脏肾小球受损,产生多种免疫反应产物、炎症因子及非免疫产物,激活GMC;GMC同时释放多种炎症介质,细胞外基质大量聚集,进一步损害肾小球;如此恶性循环,导致肾小球硬化[3-4]甚至肾功能衰竭。有研究表明,普伐他汀联合二甲双胍治疗2型糖尿病合并高脂血症能明显改善血糖血脂异常,效果良好,且无严重不良反应发生[5]。本文观察2种药物联用对GMC增殖的影响,为临床治疗DN提供药理依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 肾小球系膜细胞(武汉博士德生物有限公司,批号:HBZY-1)。药品:普伐他汀片(上海三共制药有限公司,规格:20 mg×7片,批号:110615-12);盐酸二甲双胍缓释片(中美上海施贵宝制药有限公司,规格:0.5 g×20片,批号:110823-02)。试剂:D-Hanks溶液及1640营养液(上海研拓生物);胰蛋白酶(1∶250)(武汉禾元生物);胎牛血清(上海劲马生物);乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(广州市鼎盈贸易有限公司);二甲基亚枫(DMSO)及噻唑兰(MTT)(西宝生物)。仪器:CO2培养箱(长沙长锦科技有限公司);微量加样器、超净工作台、电子天平(精准度为0.01 g)、离心机,上海普林斯顿生物科技发展有限公司;Multiskan FC酶标仪(美瑞泰克科技);96孔板细胞培养板(上海研拓生物)。RPMI-1640(Roswell Park Memorial Institute,RPMI,洛斯维公园纪念研究所研发的一类培养基)培养液的配制:取1袋1640粉剂,溶于双蒸水中,称取2 g NaHCO3粉末、2.38 g谷氨酰胺,加入上述1640溶液中,加双蒸水至1 000 mL,再用浓度均为0.1 mol/L的HCl溶液和NaOH溶液调节pH值至6.9,滤菌器过滤后分装置于-20℃保存备用。EDTA-胰蛋白酶溶液的配制:分别称取0.25 g胰蛋白酶粉末、0.04 g EDTA溶于100 mL D-Hank'S液,搅拌混匀,经微孔滤膜过滤除菌,即得0.04%EDTA-0.25%胰蛋白酶溶液,用小青霉素瓶分装保存于-20℃恒温箱备用。

1.2 方法

1.2.1 GMC的传代培养[6]GMC购回即弃去培养液,加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液,第2天开始取细胞株进行传代培养:吸掉培养液,加1~2 mL EDTA-胰酶消化液,轻摇培养瓶,使所有细胞表面均有消化液。轻轻吹打细胞,吸出消化液和细胞,加入15 mL离心管内,2 000 r/min离心10 min,吸出上清液,加入培养液;再次以2 000 r/min离心10 min,吸出上清液;加入含20%胎牛血清的RPMI-1640培养液。分装2个25 cm2培养瓶,置入饱和湿度、37℃、5%CO2恒温培养箱培养。每3天换1次液并进行传代,共传3~4代。取第4代GMC进行下游操作。

1.2.2 高糖刺激GMC增殖 根据文献报道[7-8],葡萄糖浓度为0.6 g/L时刺激作用最明显。本试验取上述第4代的细胞悬液,接种于96孔培养板,每孔200 μL,约含3×104个细胞,细胞贴壁后,使细胞生长同步于对数生长期,保持细胞间具有可比性。设 0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 g/L 5 个葡萄糖组,另设空白组,每组16孔。空白组加入蒸馏水20 μL,各试验组加入对应浓度葡萄糖20 μL。培养板置于饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱内培养,各组分别培养 12、24、48、72 h,终止前 4 h 每孔加入0.5%MTT溶液。培养4 h后,弃去上清,加100 μL DMSO中止培养,轻微震荡10 min使结晶溶解,用酶标仪在波长490 nm下检测吸光度值。

1.2.3 普伐他汀联合二甲双胍对高糖刺激GMC增殖的影响 采用“1.2.2”项下的方法,在葡萄糖0.6 g/L 20 μL刺激结束后,设5组:空白组为未经葡萄糖处理的细胞,加入20 μL蒸馏水;高糖组加入20 μL蒸馏水;大剂量组加入5.3 mg/L普伐他汀和400 mg/L二甲双胍各10 μL;中剂量组加入2.7 mg/L普伐他汀和200 mg/L二甲双胍各10 μL;小剂量组加入 1.3 mg/L普伐他汀和100 mg/L各10 μL。每组18个孔,同步进行,各组在24、48、72 h后分别取出20 μL 加入 0.5%MTT溶液,后续操作同“1.2.2”项。高糖组及药物组在药物干预期间均未再加糖处理。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0软件,计量资料以±s表示,组间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度葡萄糖不同时间点对GMC增殖的影响 在相同培养条件下,空白组细胞在不同时间点细胞生长明显比葡萄糖各组慢(P<0.05);0.6 g/L组对GMC增殖的刺激作用明显比其他剂量组强(P<0.05),见表1。

表1 不同浓度葡萄糖不同时间点对GMC增殖的影响

2.2 普伐他汀联合二甲双胍对高糖刺激的大鼠GMC增殖的影响 在相同培养条件下,高糖组细胞生长速度明显高于空白组(P<0.05),表明葡萄糖诱导大鼠GMC细胞增殖模型成功;普伐他汀联合二甲双胍不同剂量组细胞在48、72 h生长速度较高糖组明显减缓(P<0.05);大剂量组与中剂量组48、72 h生长速度差异无统计学意义(P>0.05);大剂量组与小剂量24 h生长速度差异无统计学意义(P>0.05),而72 h生长速度较小剂量组明显减缓(P<0.05),见表2。

表2 普伐他汀联合二甲双胍不同浓度在不同时间点对高糖刺激大鼠GMC的影响

3 讨论

GMC是肾脏血管周围反应活跃的肾小球细胞,具有多种功能,可产生细胞外基质和细胞因子,且可通过吞噬、处理免疫复合物,清除大分子蛋白,保持肾小球滤过膜的通透性。当肾小球受局部因素和体循环而来的介质损伤时,GMC首先受损害[9-10],因此,GMC是肾小球肾炎病变的关键环节。正常情况下GMC不发生明显增殖,但在高糖等因素作用下,可见GMC及细胞外基质同时发生异常增生,导致肾组织纤维化和硬化。DN以肾脏硬化性病变为主,病理可见毛细血管基底膜增厚,系膜区扩张、基质增多。DN早期,GMC在高糖环境下可代偿性调控葡萄糖的异常代谢,出现细胞肥大,但数目增加不显著。因此,若能有效控制GMC异常增生,对延缓肾脏纤维化、肾小球硬化的发生、发展有重要意义[11]。有报道,高浓度葡萄糖可以促进GMC迅速增殖[12]。本研究通过观察不同浓度葡萄糖对GMC增殖的影响,发现0.6 g/L浓度最佳。然后在同样孵育环境下,以浓度为0.6 g/L的葡萄糖诱导GMC增殖,并观察普伐他汀联用二甲双胍不同剂量对GMC增殖的影响。在两药联合作用下,高糖诱导的GMC在约24 h时增殖放缓,并于48、72 h时增殖速度明显下降,在72 h后高剂量组的GMC增殖速度最慢(与中剂量组比较差异无统计学意义),但与小剂量组差异有统计学意义(P<0.05),提示该剂量对GMC增殖的抑制作用最强。因此,笔者认为普伐他汀与二甲双胍联用具有抑制高糖刺激的大鼠GMC增殖的作用,为临床治疗DN提供了实验依据,但其作用机制尚待后续研究。

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