大豆球蛋白对小肠Ca2+吸收相关酶Ca2+-ATP酶和超氧化物歧化酶活性的影响

李兴起，汪秀志，陈晶，秦学功

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆163319；2.黑龙江八一农垦大学农学院）

大豆中的蛋白质含量较高，营养成分丰富，且比较齐全、平衡，是人类主要的粮食作物之一，同时也是农业饲料中很好的日粮蛋白源。但大豆中还存在多种抗营养因子，可以抑制人体及动物体内某些消化酶的活性，并与营养物质络合成不易消化的成分，破坏动物体内的某些器官，进而对动物的生理、生长、健康等造成不良的影响[1]，其中，大豆球蛋白（glycinin）是主要的抗营养因子之一，不容易降解，可刺激机体的血液系统发生免疫反应，同时也由于其抗原性可引起人体及动物的过敏反应导致腹泄，造成营养吸收障碍[2]。钙离子是人体及动物功能执行时必不可少的微量元素之一，小肠Ca2+离子通道分布、饮食pH值及肠壁各类酶活性，如Ca2+-ATP酶和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）都可对Ca2+吸收产生影响[3]。本实验主要应用离体小肠回肠段培养法研究大豆中的主要营养抑制因子大豆球蛋白glycinin对Ca2+吸收的作用，并探讨glycinin影响人体及动物微量元素吸收的相关酶活性机制。

1 实验材料与设备

实验中需要洁净环境的无菌操作台（哈尔滨东联电子仪器公司）。大豆球蛋白（glycinin，Gly）和葡萄糖酸钙 （Calium Gluconate，Glu-Ca2+） 以及Krebs-Ringer’s溶液（KR）均为市售产品。全自动生化分析仪为岛津CL8000。实验中所用的蛋白定量BCA试剂盒、Ca2+-ATPase和SOD活性测定试剂盒购自南京建成生物工程有限公司。所用成年SD大鼠（清洁级）体重150 g～200 g，由北京维通利华实验动物中心提供。

2 实验方法

2.1 离体外翻小肠囊的制备及处理

该实验参照文献报道并做少量改动[4-5]。实验大鼠于实验前1周内摄取低钙饮食，自由饮水，并于处死前禁食12 h，快速分离小肠回肠中段，然后用生理盐水快速冲洗肠管，每只鼠截取5cm左右肠段，置于室温的标准Krebs-Ringer’s（KR溶液）溶液中，该溶液预先通入95%O2和5%CO2混合气体。用玻璃棒将肠段轻轻翻转，并于外翻小肠囊内充以适量的Ca2+-free的Krebs-Ringer’s溶液，两端用丝线结扎备用。然后在实验前分别投放在含有10×Ca2+的Krebs-Ringer’s溶液，注意不可伤及小肠粘膜。灌流槽的Krebs-Ringer’s液温度维持在37±0.5℃，并不断充以95%O2和5%CO2混合气体。

2.2 离子浓度测定

小肠囊制作完成后（n=24），随机分为4组，即对照组（CK组）、glycinin组（Gly组，1mg·mL-1）、葡萄糖酸钙组（Glu-Ca2+组，10mg·mL-1） 和联合组[Combinae，Gly（1mg·mL-1）+Glu-Ca2+（10mg·mL-1）]，然后根据分组需要在灌流槽中分别加入相应试剂处理120 min。处理结束后，取各组肠囊内液，采用全自动生化分析仪检测Ca2+离子浓度。取肠囊中段称重后剪碎冰冻研磨制成组织匀浆如下述方法测定Ca2+-ATP酶。

2.3 Ca2+-ATPase和SOD活性测定

小肠囊制作完成后（n=24），随机分为4组，即对照组 （KR溶液组，）、glycinin组（0.4 mg·mL-1）、glycinin组（0.7 mg·mL-1）和glycinin组（1 mg·mL-1），然后根据分组需要在灌流槽中分别加入相应试剂处理120min。处理结束后，取各组肠囊内液，采用全自动生化分析仪检测Ca2+离子浓度。并取肠囊中段称重后剪碎冰冻后研磨，按1∶9（W·V-1）比例加冰冷的RIPA组织裂解缓冲液，在冰浴中用组织匀浆器（5 000 r·min-1，15 s×2次）制成组织匀浆，然后经4℃14 000 r·min-1×15 min离心，取上清备用并用BCA法进行蛋白定量。然后按试剂药盒说明书（南京建成生物工程研究所），用定磷法同时测定Ca2+-ATPase，其活性单位表示为 μmol Pi·mg-1pro·h-1，采用黄嘌呤氧化酶法（羟胺法）测定SOD活力，SOD活性定义：每mg组织蛋白在1mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活性单位（U）。

2.4 统计学处理

所有数据采用mean±sd表示，t检验作显著差异性分析，P＜0.05为差异有显著性。

3 结果

3.1 单独的大豆球蛋白可剂量依赖性抑制Ca2+-ATP酶活性，但对Ca2+的吸收影响不明显

实验中，以大豆球蛋白剂量梯度处理各组小肠囊，并测定小肠囊内液中Ca2+浓度和肠粘膜中Ca2+-ATP酶活性，结果表明单独大豆球蛋白对小肠囊Ca2+吸收无明显影响（图1），但却可剂量依赖性抑制Ca2+-ATP酶活性，各剂量处理组与对照相比均有统计学差异（图2）。

图1 单独应用大豆球蛋白处理对小肠囊无机Ca2+吸收无明显影响Fig.1 Single usage of glycinin to everted gut sacs did notaffect the absorption of inorganic Ca2+

图2 单独应用大豆球蛋白处理可剂量依赖性抑制小肠粘膜内Ca2+-ATPase活性Fig.2 Single usage of glycinin to everted gut sacs inhibited Ca2+-ATPase activitieswith dose-dependentmanner

3.2 大豆球蛋白可抑制小肠对Ca2+的吸收

实验中所观察的4个处理组中，即对照组（KR溶液组）、大豆球蛋白组（Gly组，1 mg·mL-1）、葡萄糖酸钙组（Glu-Ca2+组，10mg·mL-1）和联合组[Combine，Gly（1mg·mL-1）+Glu-Ca2+（10mg·mL-1）]，大豆球蛋白明显抑制小肠粘膜对Ca2+的吸收，Glu-Ca2+组与联合组相比较有显著性差异（**，P＜0.01）（图3）。

图3 大豆球蛋白明显抑制小肠对有机Ca2+的吸收Fig.2 Glycinin significantly inhibited organic Ca2+absorption derived from calcium gluconate

3.3 大豆球蛋白引起的Ca2+吸收抑制与Ca2+-ATP酶活性抑制相关

实验中所观察的4个处理组中，大豆球蛋白对小肠粘膜Ca2+的吸收抑制与Ca2+-ATP酶活性抑制相关，与对照相比，Gly可明显抑制Ca2+-ATP酶活性（***，P＜0.05），Glu-Ca2+组与联合组相比较，有统计差异（+，P＜0.05）（图4）。

图4 大豆球蛋白可通过抑制Ca2+-ATPase活性抑制葡萄糖酸钙的Ca2+吸收Fig.4 Glycinin inhibited absorption of Ca2+derived from calcium gluconate by inhibiting the activities of Ca2+-ATPase

3.4 大豆球蛋白glycinin可剂量依赖性增强SOD活性

实验中，以glycinin剂量梯度处理各组（KR溶液组、Gly 0.4mg·mL-1、Gly 0.7mg·mL-1和Gly 1mg·mL-1），测量其SOD活性，结果表明大豆球蛋白glycinin可剂量依赖性诱导增强SOD活性，随着glycinin浓度的增加，与对照组的差异逐渐明显（图5）。

图5 大豆球蛋白剂量依赖性诱导增强小肠粘膜内SOD活性Fig.5 Glycinin induced enhancementof superoxide dismutase（SOD）activitieswith dose-dependentmanner

4 讨论

大豆是人类主要的粮食作物之一，因优质植物性蛋白含量高和营养成分平衡使其在人类的饮食及禽畜饲料中应用广泛。但大豆中还存在多种抗营养因子，可刺激机体发生免疫反应和过敏反应等不良生理反应，进而危害人畜健康，使得针对抗营养因子的研究获得大量关注[6-8]。其中，大豆球蛋白（glycinin）是主要的抗营养因子之一，不容易降解，也是大豆中主要的过敏源之一，有报道证明大豆球蛋白与仔猪的超敏反应有关，并能诱导淋巴细胞增殖和各类刺激因子如IL-4等的表达，进而引起严重的综合症[2，9]。

大豆球蛋白对Ca2+吸收是否有影响尚无相关报道。我们将大豆球蛋白逐渐增加处理浓度，在0.4～0.1mg·mL-1范围内显示对Ca2+吸收无影响，但影响Ca2+吸收的因素有许多，如pH值、Ca2+存在状态等，为此我们将葡萄糖酸钙加入培养液中并加1 mg·mL-1的处理后再次检测Ca2+浓度，实验表明大豆球蛋白可以抑制Ca2+的吸收，该结果部分表明大豆球蛋白可影响Ca2+的吸收[10]。

Ca2+-ATPase活性与小肠对Ca2+的吸收相关[11]，我们已经初步证明大豆球蛋白影响小肠对钙离子的吸收，进而我们需要验证该结果是否与小肠粘膜内Ca2+-ATPase活性抑制有关。我们的实验结果证明：在梯度剂量处理下，尽管大豆球蛋白不明显影响小肠粘膜对Ca2+的吸收，但仍然能够剂量依赖性的抑制小肠粘膜内Ca2+-ATPase活性，并且1 mg·mL-1处理对葡萄糖酸钙中钙吸收相关Ca2+-ATPase活性检测也证明了这一点。

同时，文献报道显示，各类有害因素（放射、内毒素、缺血）引起的对肠损伤可抑制肠粘膜中SOD活性[12-13]，为此，我们也探讨了大豆球蛋白是否也可抑制SOD活性引起氧化损伤加强对肠粘膜损伤，但我们的实验观察到，大豆球蛋白可剂量依赖性的诱导SOD活性增强，初步推测这一矛盾结果可能是大豆球蛋白反馈性诱导SOD活性增强以减少氧化损伤，其原因可能与大豆球蛋白处理时间有关，因多数研究是在体状态下的实验，处理时间也多为数周甚至数月，损伤明显，而我们的实验是离体小肠囊实验，小肠本身存活时间就短，处理时间也短，因此结果不一致，同时，因目前尚无大豆球蛋白对SOD影响相印证，因此大豆球蛋白对SOD活性影响值得进一步探讨。

综上所述，实验初步证明大豆球蛋白通过抑制Ca2+-ATPase活性阻碍Ca2+的吸收及转运，并可能通过反馈性的增强SOD的活性以减少氧化自由基对粘膜的进一步损伤，为营养抑制因子的研究与应用提供了可靠的基础理论支持，其中一些问题值得进一步深入研究。

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