白花蛇舌草注射液无菌检查方法验证

钱丹华，王 巍，蒋克海

白花蛇舌草注射液由天然地道药材精制而成，具有清热解毒、消痛散结、利尿除湿之功效。用于温热蕴毒所致的呼吸道感染，扁桃体炎、肺炎、胆囊炎、阑尾炎、痈疥脓肿及手术后感染，亦可用于癌症辅助治疗。根据药典要求，本品需接受无菌检查方法学验证。通过对白花蛇舌草醇提物进行了大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌的敏感性实验，结果表明，白花蛇舌草对3种细菌表现出较强的抑菌活性[1]。无菌检验方法的主要目的在于对试验样品在特定实验条件下是否具有抑菌活性，具有抗菌活性的注射剂进行无菌检查时必须选择适宜的方法消除其抗菌作用，才能保证检查结果准确性和可靠性[2-3]。

1 材料与仪器

1.1 材料 (1)样品:白花蛇舌草注射液，规格:2 ml/支;批号:110428 110526 110603;生产单位:安徽凤阳科苑药业有限公司。(2)培养基:硫乙醇酸盐流体培养基、真菌培养基、营养肉汤、普通斜面、真菌斜面、营养琼脂、玫瑰红钠琼脂(均由北京三药科技开发公司提供)。(3)验证菌种:①金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003];②枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501];③大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102];④生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B)64941];⑤白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001];⑥黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]。(4)试液[4]:稀释液:PH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液;冲洗液:0.1%蛋白胨缓冲液以上经121℃高压蒸汽灭菌30 min。

1.2 仪器 恒温恒湿培养箱、霉菌培养箱、薄膜过滤器 、HTY-2000集菌仪、全封闭集菌培养器、电热鼓风干燥箱 、压力蒸汽灭菌器、净化工作台。

2 方法与结果

2.1 菌液的制备 取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中，35℃培养24 h。取经35℃培养24 h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌肉汤培养物1 ml，加9 ml生理盐水，10倍稀释至约10－7。取经35℃培养24 h的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基培养物1 ml，加9 ml生理盐水，10倍稀释至10－7，混匀备用。白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂培养基中，25℃培养48 h。取经26℃培养72 h的白色念珠菌改良马丁琼脂培养基斜面培养物，取1 ml加9 ml生理盐水，10倍稀释至10－5，取1 ml加生理盐水9 ml，混匀备用。将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，26℃培养5～7 d，使大量的孢子成熟。取经25℃培养7 d的黑曲霉改良马丁琼脂培养基斜面培养物，加入生理盐水4 ml洗下孢子，吸出转移至空试管作为原液，稀释至10－4，取0.5 ml加生理盐水10 ml混匀备用。

2.2 菌液计数 分别取上述5种细菌菌液1 ml加入培养皿，每种菌液做平行2皿。注入营养琼脂约18 ml。35℃培养(生孢梭菌置厌氧培养箱中培养)。分别取上述2种真菌菌液1 ml加入培养皿，每种菌液做平行2皿。注入玫瑰红钠琼脂约18 ml。26℃培养。实验结果见表1～表2。

表1 细菌数计数

表2 真菌数计数结果

2.3 供试液的制备 按2010版中国药典[4]规定，直接取样。

2.4 培养基的适用性检查[5]无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。无菌性检查:每批培养基随机取不少于5支(瓶)，培养14 d，结果:无菌生长。

2.5 验证实验 按2010版《中国药典》的无菌检查的验证实验方法[4]。

2.5.1 试验组 取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，每次100 ml/桶，在最后1次的冲洗液中加入少于100 CFU的试验菌，过滤。按规定将培养基直接加至滤筒内。置规定温度培养3～5 d。每天观察并记录结果。

2.5.2 阳性对照组 另取滤筒，不过滤供试品，其它操作同上，作为阳性对照，将含培养基的容器按规定温度培养3～5 d，各试验菌及相应的培养基逐一进行验证。取未加样品的滤器分别加硫乙醇酸盐流体培养基5桶及改良马丁培养基2桶，100 ml/桶。每天观察并记录结果

2.5.3 阴性对照组 2个滤器桶内各过滤0.1%蛋白胨水200 ml，然后分别加入硫乙醇酸盐培养基和真菌培养基各100 ml，不加对照菌液，分别于35℃及26℃培养。

2.5.4 培养 硫乙醇酸盐流体培养基管35℃培养;改良马丁培养基管26℃培养。观察结果。

2.5.5 结果判断 与对照组比较，所含供试品各容器中的试验菌均生长良好，说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检验条件进行供试品的无菌检查。由实验结果可知，供试菌中大肠埃希菌生长缓慢，抑菌效果明显，选为阳性对照菌。见表3～表4。

表3 细菌实验结果(24 h观察)

表4 真菌结果(48 h观察)

3 供试品的无菌检查

3.1 试验组 薄膜过滤法:将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，每次100 ml/桶，在最后1次的冲洗液中逐一加入试验菌少于100 CFU。按规定将培养基直接加至滤筒内。每天观察并记录结果。

3.2 阳性对照 大肠埃希菌菌液制备:取经36℃培养24 h的大肠埃希菌营养肉汤培养物1 ml，加9 ml生理盐水，10倍稀释至10－5，混匀备用。取2瓶样品，薄膜过滤后冲洗，最后1次冲洗前加入菌液(10－5)1 ml。加入硫乙醇酸盐培养基100 ml。

3.3 阴性对照 2个滤器桶内各过滤0.1%蛋白胨水200 ml，然后分别加入硫乙醇酸盐培养基和真菌培养基各100 ml，不加对照菌液，分别于35℃及26℃培养。

3.4 培养 硫乙醇酸盐流体培养基管35℃培养;改良马丁培养基管26℃培养。观察结果。

3.5 实验结果 通过试验可以得出白花蛇舌草注射液采用薄膜过滤法进行无菌检查[6]，该品种采用取样量20支，冲洗液为0.1%蛋白胨缓冲液，冲洗量200 ml/桶的检验条件消除抑菌性，其抑菌作用可忽略不计，阳性对照菌选用大肠埃希菌。见表5。

表5 大肠埃希菌实验结果(大肠埃希菌菌数82CFU)

4 讨论

无菌检查的目的是既要保证所有阳性对照菌正常生长，又要准确无误地检查染菌情况。药品无菌检查准确与否的关键是试验中对其抑菌性的有效消除，验证菌株的冲洗量差异会影响实验结果，因而应选择大冲洗量，以免漏检。有实验[7]表明浓度降低和加大冲洗量残留影响不大。增加冲洗量可减少供试品抑菌活性的干扰，如样品管的微生物生长良好，则该检验量已去除其抑菌作用;如样品管的微生物生长微弱、缓慢或不生长，则该检验量仍有抑菌作用，需消除。在增加冲洗次数时，每片膜的冲洗量一般不超过1 000 ml。否则，需验证加大冲洗量对滤膜质量无影响，并选择对样品吸附作用较低的滤膜。

通过对本品冲洗液冲洗量(100，200 ml)的考察，表明白花蛇舌草注射液对大肠埃希菌最为敏感，冲洗量为200 ml/桶，可以消除样品的抑菌活性，使6株试验菌均可正常生长，本样品可以采用薄膜过滤法经0.1% 蛋白胨缓冲液冲洗200 ml(总冲洗量)，此方法用于白花蛇舌草注射液的无菌检查是可行的。通过无菌检验方法验证能够全面掌握测定方法和能够准确检测方法的有效性，能够全面适用于该供试品的检验，避免产生假阴性和假阳性，更有利于对药品质量的控制保证药品安全[8]。

[1]陈秀珍，朱大诚，王艳辉.白花蛇舌草药理作用及临床应用研究新进展[J].中药材，2009，32(1):157-161.

[2]廖荣寿.克林霉素磷酸酯注射液无菌检查方法学验证[J].海峡药学，2011，23(1):56-57.

[3]李贞顺，韩映晨.无菌检验方法在药品生产企业中的应用[J].中国现代药物应用，2011，5(19):137-138.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京:中国医药科技出版社，2010，(1)，76-79.

[5]马绪荣，苏德模.药品微生物学检验技术[M].北京:华龄出版社，2007:209-273.

[6]中国药品生物制品检定所.中国药品标准操作规程[S].2010.

[7]莫慧珍，许则省.注射用盐酸克林霉素的无菌检查方法验证[J].今日药学，2006，19(6):39-42.

[8]陈万胜.浅淡药品生产企业无菌检验方法验证[J].中国实用医药，2011 ，6(3):245.