毕赤酵母表达系统研究进展

马银鹏，王玉文，党阿丽，孔祥辉，2，张介驰，2

(1.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨150010;2.黑龙江省科学院高技术研究院，哈尔滨150020)

大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统由于其具有遗传背景和生化特性清楚、成本低廉、操作简便、生产效率高等优点最早被采用作为外源基因表达系统。但大肠杆菌表达系统缺少真核生物的蛋白翻译后进行加工和修饰的功能，表达的蛋白大部分以包含体形式存在，且需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性以及背景杂蛋白较多[1］，为克服这些缺点，人们于1979年开发了酵母表达系统。

酵母是单细胞低等真核生物，既具有原核生物细胞生长速度快、容易培养、操作简单等优点，又具有真核生物表达时对蛋白质的加工和修饰等功能。因此相对于原核表达系统表达出的不具有活性的蛋白，酵母表达出的蛋白是具有生物学活性的，而且酵母表达系统比其他真核表达系统如昆虫、哺乳动物组织等表达系统快速、简便、成本低[2］。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)最早被用作酵母表达系统的宿主。1981年Hitzeman等用它成功表达了人干扰素基因[3］。第一个商品化的重组疫苗也是由酿酒酵母表达的[4］。酿酒酵母全基因组于1996年测序完成，更多的蛋白如乙肝表面抗原、人胰岛素、人血清蛋白和降钙素等通过其成功表达[5］。由于其具有难以高密度培养，缺乏强有力的启动子，分泌效率低等局限性[1，6］，因此人们在此基础上又寻找了新的酵母表达系统宿主——毕赤酵母(Pichia pastoris)[7］。

1 毕赤酵母表达系统的特点

毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母，以甲醇为唯一的碳源和能源[8］。毕赤酵母具有强有力的醇氧化酶基因AOX启动子，是目前最强、调控机制最严格的启动子之一。它能够严格调控外源基因的表达，使外源基因只在含有甲醇的培养基中有效表达。基因组中存在两个基因AOX1和AOX2，对AOX基因进行编码，两个基因的同源性为92%，编码蛋白质的同源性高达97%。AOX1启动子受到甲醇的诱导强烈，但是AOX2启动子受甲醇诱导较弱[9］。一般情况下外源基因整合到毕赤酵母染色体上，随着染色体的复制而复制，不易丢失，遗传性状稳定。毕赤酵母在氧气充足时能快速生长，通过连续培养可形成很高的细胞密度。因此，毕赤酵母可应用于大规模工业化发酵生产[10］。在1993年，RCT(Research Corporation Technologies)允许毕赤酵母表达系统用于学术研究，这使该系统的知识库呈现了爆炸性增长[2］。

2 毕赤酵母表达系统的组成

2.1 表达宿主

目前利用的毕赤酵母表达宿主是由野生菌株NRRLY 11430(Northern Regional Research Laboratories， IL，USA)改良的。常用的毕赤酵母菌株有组氨酸缺陷型、腺嘌呤缺陷型和蛋白酶缺陷型。所有菌株均属于组氨酸缺陷型，这类菌株只能在含有组氨酸的培养基中生长，这有助于在无组氨酸的培养基上筛选转化成功含有组氨酸质粒的阳性转化子[7］。PMAD11和 PMAD16属于腺嘌呤缺陷型。SMD1163、SMD1165和SMD1168为蛋白酶缺陷型，基因组中缺失编码蛋白酶A(pep4)或编码蛋白酶B(prb1)的基因，减弱了蛋白酶对外源蛋白的降解作用，为外源基因的高效表达提供了一个稳定的环境，适用于分泌型表达。由于毕赤酵母中1个或2个AOX基因的缺失，造成其对甲醇的利用能力不同，毕赤酵母菌株分为3种表现型。GS115、SMD1163、SMD1165和SMD1168菌株含有完整的AOX1和AOX2，在甲醇为唯一碳源时，强烈诱导启动子使外源基因大量表达，为甲醇快速利用型Mut+。其中以GS115应用最广泛。KM71菌株无AOX1但是有AOX2，利用甲醇效率较低，为甲醇慢速利用型Muts。MC100－3菌株中的AOX1和AOX2均被敲除，不能利用甲醇，为甲醇不能利用型Mut－。常见毕赤酵母菌株、基因型和表现型如表1所示:

表1 毕赤酵母表达菌株Tab.1 The host strains of P.pastoris expression system

2.2 表达载体

毕赤酵母中没有稳定的天然质粒，通常利用整合型穿梭质粒作为外源基因的表达载体。携带外源基因的表达载体先在大肠杆菌中复制扩增，然后导入宿主细胞中与酵母细胞染色体基因组整合，表达外源蛋白。典型的毕赤酵母表达载体含5'AOX1启动子、3'AOX1终止子、his4营养缺陷型筛选标志、多克隆位点、大肠杆菌Ampr和ori序列[1］。

毕赤酵母表达载体中没有酵母复制起点，它依靠AOX1或HIS4基因的位置同源重组整合进入酵母染色体中。质粒整合到毕赤酵母染色体有单一交叉插入和双交换两种方式。含有外源基因的载体通过单交换方式插入宿主染色体的HIS4位点或AOX1的上游或下游，AOX1基因仍能正常表达，得到的多拷贝的转化子，表型为Mut+。含有外源基因的载体通过双交换方式插入到染色体AOX1基因位点，不能正常表达AOX1基因，但是可以表达AOX2基因，形成的单拷贝转化子，表型为Muts。

载体转化到毕赤酵母中的方式包括原生质体转化法、电转化法、聚乙二醇法和氯化锂法。其中原生质体转化法和氯化锂法转化效率较高[11］。原生质体转化法易形成高拷贝数，但是步骤较烦琐，且易污染。电转化法操作简便，不易污染，现已广泛使用。其他两种方法转化效率较低[12］。

2.2.1 启动子

毕赤酵母中最常用的表达外源蛋白的启动子是醇氧化酶基因启动子(PAOX1)。Yu[13］利用 PAOX1启动子在毕赤酵母GS115中成功表达了超氧化物歧化酶，表达的蛋白具有免疫学活性和酶活性。Ghaffar等[14］也利用该启动子在毕赤酵母GS115中成功表达了来自嗜热毛壳菌的耐热木聚糖酶，培养96 h后的最大胞外酶活性达15.6 U/mL。但是该启动子也存在一定的缺陷，如甲醇有毒、易挥发，诱导时需连续添加甲醇，不适用于食品生产，大量甲醇积累可能会引发火灾。3－磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子(PGAP)经葡萄糖诱导能提供与PAOX1启动子相当的表达水平，而且培养过程中不需要更换碳源。Vellanki等[15］利用PGAP启动子成功地在毕赤酵母中表达了乙肝表面抗原。Yang等[16］也利用该启动子在毕赤酵母中表达了－淀粉酶。但是PGAP启动子不适用于表达对酵母有毒性作用的蛋白。谷胱甘肽依赖性甲醛脱氢酶基因(FLD1)编码毕赤酵母甲醇诱导途径中的一种关键酶，该基因可被甲醇和甲胺诱导表达，也可被用作毕赤酵母启动子(PFLD1)。当利用甲胺诱导外源蛋白表达时，可以利用葡萄糖或甘露糖取代甲醇作为碳源，或者甲醇既是碳源又是诱导剂[17］。

2.2.2 选择标记

表达载体上的选择标记基因可用于筛选阳性转化子和高拷贝转化子。营养缺陷型基因如HIS4、SUC2、ARG4等已经被用来连接到营养缺陷型的宿主菌株上，用于筛选阳性转化子。抗生素抗性基因如Zeocin、Kanr等都能在毕赤酵母中表达，常用于筛选高拷贝的阳性转化子。一般是先筛选出阳性转化子，然后再筛选出高拷贝阳性转化子。

2.2.3 信号肽

毕赤酵母表达的外源蛋白可通过细胞内和细胞外两种方式表达。细胞外表达外源蛋白优于细胞内表达，由于毕赤酵母分泌很少的自身蛋白，而细胞外表达可避免从细胞内分离蛋白，且培养基中不需要添加蛋白质，因此在培养基中分泌蛋白占大部分，有利于对外源蛋白的分离纯化。将外源蛋白分泌到细胞外需要在表达载体上添加信号肽序列链接到分泌途径。目前应用较成功的信号肽有酿酒酵母交配因子信号肽、酸性磷酸酶信号肽、蔗糖酶信号肽等。酿酒酵母交配因子信号肽是目前应用最广泛也是最成功的信号肽，在一些情况下优于外源蛋白的前导序列，但是利用该因子作为外源蛋白的信号肽有时会使N末端氨基酸序列发生变异。

3 外源基因表达的影响因素

毕赤酵母中外源基因的表达受到多种因素的影响，主要包括外源基因的性质和毕赤酵母培养条件两个方面。外源基因的性质主要包括UTR序列、A+T含量、密码子和基因拷贝数等。毕赤酵母培养条件主要包括培养基、温度、pH值、通气和甲醇诱导等。研究发现可以通过改变外源基因的性质和优化培养条件使外源基因在毕赤酵母中高效表达。

3.1 外源基因的性质

3.1.1 UTR 序列

mRAN 5'和3'非翻译区(UTR)的长度和序列可能影响外源基因的表达。UTR太长或太短都会造成核糖体40S亚单位的识别障碍，影响外源基因的表达。适当长度的5'UTR能够极大促进mRNA的高效表达。

3.1.2 A+T 含量

在毕赤酵母表达系统中，局部A+T含量过高会使外源基因表达提前终止。可能是因为A+T含量丰富的区域存在转录提前终止信号，使外源基因不能有效转录，因此外源基因中A+T含量影响外源基因的表达量。对A+T含量丰富的基因应利用毕赤酵母外源基因表达序列的优化软件重新设计序列，使A+T含量控制在30% ～55%理论范围内。优化软件综合考虑密码子的使用频率和A+T含量因素，优化后的序列与AOX1存在相似的特性，因此可使外源基因高效表达[18］。Gurkan等[19］使用外源基因表达序列优化软件重新设计外源基因的序列，A+T含量由70%降到50%，可使毕赤酵母高效表达细菌毒素及其衍生产物。

3.1.3 密码子

外源基因中的密码子影响外源基因的表达。毕赤酵母表达系统对密码子具有偏爱性，使用毕赤酵母偏爱的密码子可使外源基因高效表达。通过对酵母基因使用密码子的统计分析，确认了61个密码子中有25个密码子是酵母所偏爱的[20］。张朝春等[21］根据人神经营养素的基因序列，把编码氨基酸的密码子转换成毕赤酵母偏爱的密码子，结果表明使用偏爱密码子的基因在毕赤酵母菌株中的表达明显优越于对照组表达量，在诱导后72～96 h最高，达到31 mg/L左右。Li等[22］根据外源基因对密码子的偏好性，对硫色曲霉的内切β－1，4－木聚糖酶基因改造，表达产量为105 U/mL，是未改造外源基因表达产量的5倍。

3.1.4 基因拷贝数

基因拷贝数影响外源蛋白的表达量。多拷贝基因通常可以提高外源基因的表达量，外源基因的拷贝数越多，外源蛋白的表达量也就越高。利用毕赤酵母表达肝炎B表面抗原(HbsAg)时发现，包含4个基因拷贝的菌株的表达量是单拷贝菌株表达量的4倍，而且对于转录水平没有影响[23］。Li等[24］增加毕赤酵母中的脂肪酸去饱和酶与延长酶基因的拷贝数，提高花生四烯酸和十二碳五烯酸产物的含量。然而有时增加外源基因的拷贝数有可能会降低蛋白的表达量。由于资源和能量的限制，增加基因拷贝数可能对转录和翻译产生影响，这也会限制外源蛋白的表达。还可能是由于高拷贝使菌株稳定性减弱，也可能与外源基因自身特殊结构有关。对于分泌效率低的蛋白，过高的表达对毕赤酵母分泌途径产生负反馈抑制作用，不利于外源蛋白的表达。因此在选择表达菌株时不能仅仅追求高拷贝数，应以蛋白表达量为最终的标准筛选高表达菌株。

3.2 培养条件

3.2.1 培养基

培养基为酵母细胞生长提供营养物质，在培养基中添加适量的酪蛋白氨基酸和蛋白胨等，能够缓解蛋白酶对外源蛋白的水解作用，同时提供蛋白合成和分泌的原料和能量，有利于增加产物的稳定性，提高外源蛋白的表达量。这些物质可能是通过替代或竞争蛋白酶起作用，抑制蛋白酶的活性[25］。在培养基中添加一些特殊的营养物质，如含有金属的酶、金属元素等，能提高一些特殊蛋白的表达水平。在培养基中加入特异的蛋白酶抑制剂能很好地抑制蛋白酶活性，提高外源蛋白的表达。Shi等[26］在培养基中加入丝氨酸和天冬氨酸蛋白酶抑制剂，发现蛋白酶活性分别降低了53%和30%。

3.2.2 温度

毕赤酵母表达外源蛋白的适宜温度为28℃～30℃，在此温度范围毕赤酵母细胞生长速度最快，理论上外源蛋白的表达量与菌体密度呈正相关性。毕赤酵母表达外源蛋白时会产生大量的热量，当温度超过32℃时，外源蛋白的表达会停止。因此，毕赤酵母表达过程中要控制合适的温度。研究发现毕赤酵母在较低温度下有利于外源蛋白的表达，可能是外源蛋白在较高温度下的稳定性下降，不利于蛋白质折叠，也可能是死细胞释放更多的蛋白酶降解外源蛋白[27］。Li等[28］用毕赤酵母表达鲱鱼防冻蛋白时发现，低温显著增加了外源蛋白的表达量，可能是由于低温条件下增强了蛋白折叠通路和细胞生存能力。

3.2.3 pH 值

毕赤酵母能够在一个较宽的pH值范围内生长(3.0～7.0)。pH值通过影响蛋白酶活性，改变蛋白酶对外源蛋白的降解作用，来影响外源蛋白的表达量和活性。不同的外源蛋白稳定表达需要不同pH值。重组的小鼠表皮因子和人血清蛋白表达的最适pH值为6.0[29］，而类胰岛素生长因子Ⅰ在pH值为3.0时表达效果最佳。

3.2.4 通气

毕赤酵母利用甲醇表达外源蛋白时需要消耗大量的氧气，溶氧不足会抑制菌体繁殖和外源蛋白的表达，并且造成甲醇及次级代谢产物甲醛和过氧化氢的积累，对酵母细胞产生毒害作用，因此充足的通气量对毕赤酵母外源蛋白的表达极其重要。

3.2.5 甲醇诱导

甲醇是酵母表达的诱导物和唯一的碳源。在甲醇诱导期间，由于甲醇的消耗和挥发，应及时向培养基中连续补加甲醇。甲醇浓度太高对毕赤酵母细胞产生毒害，浓度太低则诱导表达的外源蛋白太少。一般甲醇的添加量为培养基体积的0.5% ～1%。

甲醇诱导时间也影响外源基因的表达量。诱导时间太短则表达的外源蛋白量少，诱导时间太长外源蛋白容易被蛋白酶降解，外源蛋白的表达量少。因此应根据载体的特点和外源蛋白的性质选择最合适的诱导时间，诱导产生最大量的外源蛋白。

4 结论

利用毕赤酵母表达外源蛋白是很高效的，通过利用高效的启动子、分泌信号、抑制蛋白酶活性和发酵控制等，研究者们已经实现了很多外源蛋白的高效表达。一定程度的流程优化，有助于产生最大量和最高活性的外源蛋白，而外源蛋白的产量和活性很大程度上依赖培养的参数，这些可以通过条件控制来满足[10］。

毕赤酵母表达系统相对于大肠杆菌、酿酒酵母、昆虫细胞等，是最简单和最可靠的外源基因表达系统[10］，现已经成功表达了细菌、真菌、病毒、植物、动物以及人类方面的相关蛋白质[30］。过去几十年来，毕赤酵母表达系统在很多外源蛋白的工业化生产中已经取代了传统的大肠杆菌表达系统和酿酒酵母表达系统。但是毕赤酵母表达系统还存在一些不足之处，外源基因在毕赤酵母中的表达和高效表达还需要更多的研究去认识，表达产物与天然蛋白的结构和功能还需要进一步的研究。但是随着现代分子生物学技术的发展，人们对毕赤酵母表达系统的研究会更加深入，有理由推测毕赤酵母表达系统将会有更大的发展和应用空间。

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