大蒜茎尖离体再生体系的建立

2013-10-10宋淑敏刘伟伟王云云王晓楠

黑龙江科学 2013年9期

宋淑敏，刘伟伟，王云云，高宇，潘静，王晓楠

(黑龙江省科学院大庆分院，黑龙江大庆163319)

大蒜(Allium sativum L.)在我国已有2 000多年的栽培历史。目前我国大蒜种植面积达26.6万hm2，占亚洲的1/2，占世界的1/3;同时中国是世界上大蒜的主要出口贸易国之一，产品远销东南亚、日本、中东、美国、俄罗斯等国家及地区，为我国换取了大量的外汇。大蒜具有很高的营养价值，是很好的滋补强身蔬菜。大蒜对多种致病微生物及寄生虫有较强的抑制或杀灭作用，被医务工作者称为植物性广谱抗生素，它对心脏病、高血压和某些癌症也有预防作用。随着经济的发展，人们越来越重视大蒜的营养以及保健价值，大蒜的需求量逐年增加，大蒜及其加工产品已广泛应用于调味品、食品、医药、饲料及美容等行业。

黑龙江省是我国大蒜的主产区，其中阿城大蒜、宁安大蒜以其独特的风味和极佳的品质享誉全国，深受广大消费者的喜爱，并远销到日本、韩国等地。1998年阿城被国家命名为“中国北方大蒜之乡”，2008年“阿城大蒜”注册为农产品国家“地理标志”商标。但由于多年的连作致使品质退化，具有800年种植历史的阿城大蒜种植业正走向衰退、崩溃的边缘。阿城紫皮大蒜退化的根本原因为是由于农民常年自留蒜种，在使用过程中严重感染病毒病，致使品种严重退化，产量和品质降低。据测定，大蒜病毒病发病率达到90%以上，大蒜感染病毒病主要表现为蒜头逐年变小、产量低、品质差，一般减产达到30% ～50%;不仅直接造成农业损失，也使我省的名、优、特品种失去了市场竞争优势，甚至使一些珍稀品种濒临灭绝，严重制约了我省大蒜产业发展。应用组织培养技术培育、繁育脱毒蒜用于生产是防治病毒病的有效途径。国内外关于大蒜脱毒苗的培育已有大量的研究，应用茎尖分生组织培养获得脱毒苗是当前普遍采用的方法，许多品种都已获得了脱毒苗。但应用茎尖组培脱毒，因取材较小，茎尖成活率和分化率不高，繁殖系数低，严重地制约了大蒜脱毒种苗的繁育及应用进程。目前黑龙江省大蒜生产上急需优质脱毒种蒜，但我省还没有专门从事大蒜脱毒及原种繁育为一体的科研单位。

本研究的目的是以黑龙江省名优大蒜茎尖为材料，采用不同浓度激素、蔗糖进行配比，筛选高效的分化、继代、生根培养基;对茎尖离体培养技术和培养条件进行系统研究，以期探索一套适于黑龙江省名优大蒜茎尖脱毒技术体系，为大蒜脱毒种苗的工厂化生产提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

选用新收获的阿城大蒜，将鳞茎放入4℃～6℃的冰箱中贮藏30～40 d，以打破休眠备用。

1.2 材料预处理及外殖体表面消毒

挑选无病斑的鳞茎，将鳞芽剥去表皮，用纱布包裹好，先用自来水冲洗0.5 h，然后在超净台上，用75%的酒精表面消毒2 min，再用20%的次氯酸钠表面消毒20 min，然后用无菌水洗3次。

1.3 茎尖剥离方法及培养条件

在超净工作台上，用解剖刀剥取经表面消毒鳞芽里面的叶芽，放在40倍解剖镜下，再用解剖刀剥取0.2～0.5 mm的茎尖，接种到培养基上。然后放在室温为25℃，光照强度为2 000 LX，光照时间为12 h/d的培养室中培养。

1.4 基本培养基的筛选

以阿城大蒜茎尖为材料，分别接种到附加6—BA1.0 mg/L、NAA0.1 mg/L 的 MS、B5、N6培养基中，接种15d 后统计茎尖的成活率和绿苗繁殖倍数。

1.5 不同浓度激素配比对茎尖分化率的影响

以MS为基本培养基上，附加不同浓度的6—BA、NAA、IAA的激素组合，共设了8个处理，每个处理接种茎尖90个，15 d后统计茎尖分化率和绿苗繁殖倍数。

1.6 继代培养基筛选

当从茎尖分化出的绿苗高2 cm左右时，应及时转入到继代培养基中。继代培养基以1/2MS为基本培养基，对6—BA 0 ～0.5 mg/L、NAA 0 ～1.0 mg/L、IAA 0 ～1.0 mg/L 不同浓度激素进行配比试验，pH为5.8～6.0，共设13个处理，15 d后观察统计苗的长势及生根情况。

1.7 生根培养基筛选

以1/2MS培养基成分为基础，pH值为5.8～6.0，调整植物激素 IAA(0.1 ～0.5)mg/L、NAA(0.1 ～0.5)mg/L、蔗糖(10 000～60 000)mg/L浓度，共设G1～G15组进行试验。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对茎尖分化率和绿苗的增殖倍数的影响

我们选用B5、MS、N6三种培养基作为茎尖分化培养基，三种培养基均附 1.0 mg/L6—BA、0.1 mg/LNAA，pH 为5.8～6.0。试验结果如表1所示。

表1 B5、MS、N6培养基对大蒜茎尖分化的影响Tab.1 The effect of B5、MS、N6medium on the differentiation of garlic shoot-tip of

从表1的试验结果我们可以看出，不同培养基对茎尖分化率影响差异显著，以MS培养基培养效果最好，茎尖的分化率、绿苗的增殖倍数最高;B5培养基培养效果要好于N6培养基。试验结果表明，大蒜茎尖分化培养基的优劣顺序为MS＞B5＞N6。

2.2 不同激素配比对茎尖分化率及绿苗繁殖倍数的影响

我们以MS培养基为茎尖分化的基础培养基，并附加了不同浓度的 6—BA、NAA、IAA，pH 为 5.8 ～ 6.0，共设了8个处理。茎尖接种到分化培养基中，20 d后统计茎尖分化率及绿苗增殖倍数。试验结果如表2所示。

表2 不同浓度激素配比对茎尖分化率及绿苗增殖倍数的影响Tab.2 Effects of different concentrations of hormones on rate of shoot-tip differentiation and multiplication of green plantlet

从表2可以看出，8个处理均有绿芽的分化，但以1.0 mg/L6—BA+0.1 mg/LNAA 激素组合效果为最好，茎尖的分化率达93.3%，繁殖倍数为5.2;当6—BA浓度超过1.5 mg/L，随着6—BA浓度的增加，茎尖的分化率降低，分化出玻璃苗的数量增加。因此，最佳的茎尖分化培养基为F3:MS+1.0 mg/L6—BA+0.1 mg/LNAA。

2.3 不同继代培养基对苗的长势影响

表3的试验结果表明:在13种继代培养基中，D3、D7、D8培养基继代效果较好，其中以D7培养基的继代效果最好，在D7培养基中幼苗生长健壮，苗的成活率最高，达100%。其次是D3，该培养基中苗的成活率较高，并有一定数量的幼苗生根，但苗的成活率低于D7。因此，最适的继代培养为:1/2MS+0.2 mg/L6—BA+0.2 mg/LNAA。从表 3中我们还可以看出当继代培养基附加6—BA 0.1 mg/L时，NAA浓度0.2～1.0 mg/L，随着NAA增加绿苗的成活率和生根率也随之增加。

表3 不同继代培养基对绿苗长势的影响Tab.3 Effects of different subculture medium on growth of green plantlet

2.4 生根及移栽

选取3～5 cm高的试管苗，在超净台上将苗基部的愈伤组织去除，分别转入到15种生根培养基中，pH为5.8～6.0，在25℃ ～28℃，光照强度为2 000 LX，光照时间为12 h/d条件下培养，20 d后统计生根率、根长、试管鳞茎的诱导率。当根长达2～3 cm时，打开瓶膜，加入一定量的蒸馏水，让试管苗充分吸收水分，炼苗1～3 d，然后将根部的培养基洗净，进行移栽，移栽后要浇透水，注意避光、保湿，15 d后统计移栽成活率。试验结果如表4所示。

试验结果表明:不同浓度生长素、蔗糖对根的诱导率和生根数有较大影响，其中以 1/2MS附加0.1 mg/LIAA、0.5 mg/LNAA、60 000 mg/L蔗糖组合的效果最佳。在该组合培养基中，大蒜试管苗植株健壮，不定根发生数量较多，并对试管鳞茎的形成有一定的促进作用，有利于试管苗移栽成活。试管苗的生根率达95%，移栽成活率为98.6%，试管微鳞茎的诱导率为15%，均高于其他组。因此，最佳的生根培养基为:1/2MS 附加 0.1 mg/LIAA、0.5 mg/LNAA、60 000 mg/L蔗糖。

3 小结

A.本研究初步建立了适于黑龙江省大蒜茎尖离体再生技术体系。获得试管苗7 000余株。为培育优质、高产的黑龙江大蒜奠定了基础，对解决黑龙江省名优品种种性退化、促进大蒜产业发展及提高农民收入具有重要意义。

B.本试验筛选出最适茎尖分化培养基MS+1.0 mg/L6—BA+0.1 mg/LNAA，茎尖的分化率达 93.3%，繁殖倍数为 5.2;最适继代培养基 1/2MS+0.2 mg/L6—BA+0.2 mg/LNAA。最佳的生根培养基为1/2MS附加0.1 mg/LIAA、0.5 mg/LNAA、60 000 mg/L 蔗糖。