超高压处理对牛初乳中微生物的影响

任 杰，胡志和，刘 洋

（天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津300134）

牛初乳是母牛提供给新生牛犊用来抵抗外来微生物的一种乳品，其含有丰富的优质蛋白质、维生素和矿物质等营养成分[1]，同样富含免疫球蛋白、生长因子等活性功能组分[2-3]，能消灭侵入人体的致病原[4]，抑制病菌繁殖，是一种能增强人体免疫力、促进组织生长的功能性健康食品[5-6]。大量研究证明，牛初乳是除人初乳外惟一富含生长因子和免疫因子的天然食物，被认为是替代人初乳的最佳乳品[7]。然而近年来，由于污染致病菌而引起的乳品中毒事件常有发生[8-9]，使得乳品安全问题成为了人们关注的焦点。尤其是存在于乳中的金黄色葡萄球菌是引起我国食物中毒的主要病原菌，它能杀死白细胞素，引起人的化脓性感染、肺炎、伪膜性、肠炎和脓毒血症等疾病[10]；而且它一旦进入人体，肠毒素会引起急性胃肠炎，这已成为世界性的公共卫生安全问题[11-13]，血浆凝固酶会造成局部化感染[14]，溶血毒素会引起局部缺血甚至坏死[15]。乳品中的微生物含量是衡量其品质好坏及货架期的关键因素。超高压处理（ultrahigh pressure processing，UHP）作为物理作用的非热杀菌技术[16]，能够杀灭微生物，保留食品的天然色泽、香气成分与营养价值等[17]，同时还能够增强乳蛋白的可消化性[18]。超高压技术结合冷冻干燥生产牛初乳，可克服传统加工方式的缺陷，改善牛初乳制品的生物安全性，提高其质量。本实验以灭菌压力、保压时间和温度为因素，研究超高压处理对牛初乳中微生物的影响，初步确定牛初乳超高压灭菌的工艺条件，为超高压技术在牛初乳中的应用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛初乳 由德兴隆有限公司提供；蛋白胨、酵母膏等生化试剂 北京奥博星生物技术有限责任公司；琼脂粉、葡萄糖等生化试剂 天津市元立化工有限公司；NaOH、NaCl等试剂 天津市化学试剂批发公司；微生物测试纸 广州绿洲生化科技有限公司。

HPP.L3-600/0.6型超高压设备 天津市华泰森淼生物工程技术有限公司；SW-CJ-1F型博讯超净工作台 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；LRH-70型生化培养箱 上海一恒科技有限公司；Astor 20菌落计数器 深圳菲特立科技有限公司；VELP漩涡振荡器 德祥科技有限公司；循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；塑料薄膜封口机 浙江江南实业有限公司。

1.2 牛初乳的超高压处理

量取5mL左右的生鲜牛初乳装于聚乙烯塑料袋内，真空密封后进行超高压处理，检测处理前后的菌落总数和金黄色葡萄球菌数量。

1.2.1 压力对牛初乳中微生物的影响 温度维持在30℃，保压时间20min，压力分别选取100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600MPa处理牛初乳，以未经高压处理的样品作为空白对照组，检测样品中菌落总数和金黄色葡萄球菌数量。

1.2.2 保压时间对牛初乳中微生物的影响 在压力350MPa，温度为30℃，不同时间（10、20、30、40、50、60min）下处理牛初乳，空白对照组为未经高压处理的样品，检测处理前后样品的菌落总数和金黄色葡萄球菌的数量。

1.2.3 温度对牛初乳中微生物的影响 在压力为350MPa，保压时间20min，温度分别选取10、15、20、25、30、35、40℃处理牛初乳，未经高压处理的样品为空白对照组，测定样品中的菌落总数和金黄色葡萄球菌数量。

1.2.4 超高压杀菌条件优化 选用处理压力、作用温度和保压时间作为实验因素，进行L9（34）正交实验，同时将未经高压处理的牛初乳作为空白对照组，筛选微生物致死率较高的压力、温度和时间组合。正交实验设计见表1。

表1 L9（34）因素水平表Table 1Factor-level design L9（34）

1.3 微生物的检测

菌落总数的测定根据国家食品微生物检验标准GB 4789.2-2010进行，金黄色葡萄球菌的检测采用测试纸片法，将处理好的样品吸取1mL接种于测试纸片上，将上层膜缓慢盖下，待培养基凝固后，再将测试纸片叠放在一起放回原自封袋中并封口，置于恒温培养箱中培养。培养温度为（36±1）℃，培养15～24h。每个样品检测三次，取其平均值进行计算。

1.4 致死率的计算

致死率（%）=（对照组的平均菌数-处理后样品的平均菌数）/对照组的平均菌数×100

式中：对照组的平均菌数—在常压下所测得的菌落总数平均值或金黄色葡萄球菌的平均值，此时的致死率为0；处理后样品的平均菌数—牛初乳经超高压处理后所测得的菌落总数平均值或金黄色葡萄球菌的平均值。

1.5 数据处理

数据分析和图表制作利用软件Excel 2007。

2 结果与分析

2.1 压力对牛初乳中微生物的影响

在温度为30℃、保压时间为20min的条件下，采用不同的压力处理牛初乳，结果如图1所示。

由图1可知，随着牛初乳所受压力的增加，灭菌效果也越来越好，说明超高压对金黄色葡萄球菌与菌落总数的作用效果一致。菌落总数的致死率曲线显示，当压力从常压增加至300MPa时，灭菌效果非常明显，菌落总数由原来的1.3×107减至1.8×106，下降了一个数量级，菌落总数的致死率呈上升趋势，压力对菌落总数的影响基本遵循一级反应动力学模型；当压力增加至400MPa时，灭菌曲线的上升趋势逐渐趋于平缓；当压力超过400MPa时，牛初乳中的菌落总数致死率达到95.6%，细菌总数下降到5.7×105；压力增至550MPa时，未检测到微生物，致死率达到100%。

由金黄色葡萄球菌的致死率曲线可得，当样品所受压力不超过300MPa时，随着所施压力的升高，金黄色葡萄球菌的数量由原来的5.0×104减至1.2×102，金黄色葡萄球菌的致死率呈直线上升趋势；当压力达到或超过400MPa时，致死率达到了100%。

超高压灭菌的原理在于高压使得微生物的细胞形态、遗传机制以及组织结构等都发生了改变[19]，对微生物的破坏作用主要集中于细胞膜和细胞壁[20-21]。研究表明，压力会导致细胞膜的通透性发生改变[22-23]，继而生物大分子的立体构象发生崩溃，高级结构被破坏，蛋白质凝固，酶的活性受到抑制，DNA等遗传物质无法完成复制[24]，导致了微生物的死亡[25-26]。施加压力越大，微生物细胞膜破坏的程度也就越严重，这与本实验中随着处理压强的增大，致死率逐渐上升的趋势是一致的。另外，Malicki.A等[27]的研究认为，在100～400MPa内，压力的增大能显著降低沙门氏菌的存活率，王蕊等[28]将生鲜牛奶置于14℃和430MPa的条件下施压15min，发现细菌总数的致死率达到99.5%，这些都说明了随着施加压强的增大，灭菌的效果越好。

综上，选择450、500和550MPa进行下一步的正交实验。

2.2 保压时间对牛初乳中微生物的影响

在压力为350MPa、温度为30℃的条件下，采用不同的保压时间处理牛初乳，结果如图2所示。

由图2可以看出，随着保压时间的延长，无论是菌落总数还是金黄色葡萄球菌，两者的致死率都逐渐上升。从菌落总数的致死率曲线图可以看出，当保压时间增至20min时，致死率明显上升，曲线呈线性变化；当保压时间超过30min后，菌落总数的致死率增幅趋于缓和；在50min时，致死率为98.2%；在60min时，致死率为100%。

从金黄色葡萄球菌的致死率曲线图可以看出，当保压时间在20min内时，随着时间的延长，金黄色葡萄球菌致死率的曲线较陡，上升趋势显著；继续延长保压时间，致死率虽在上升，但增加幅度变得平缓；当达到60min时，金黄色葡萄球菌致死率达到100%。

Gaenzle M G等[29]利用荧光染色技术对超高压破坏大肠杆菌细胞膜研究发现，不可逆的膜损伤与保压时间长短有关。在多数情况下，保压时间越长，超高压灭菌的效果越好，但是随着保压时间的增加，其对灭菌效果的贡献却越来越小，即当保压时间达到一定值时，其对灭菌效果已基本没有太大影响。夏元景等[30]也证实，当压力、pH等因素固定，达到一定时间后，延长保压时间，微生物的致死率将趋于平缓。这些都与图2的曲线变化图相一致：在一定的时间范围内，致死率随着时间的延长而上升；超过一定范围后，继续延长时间，则致死率变化不大。

综上，选择15、20和25min进行下一步的正交实验。

2.3 温度对牛初乳中微生物的影响

在压力为350MPa、保压时间为20min的条件下，采用不同的温度处理牛初乳，结果如图3所示。

图3显示，温度对牛初乳中细菌总数的致死作用并非呈线性相关关系，而是出现了上下波动。当温度小于20℃时，致死率随温度升高而下降；在20℃时致死率最低，超高压处理的结果最差，致死率仅为33.3%；当温度超过20℃时，致死率随温度升高又呈现上升的趋势；当温度升高到35℃时，细菌总数的致死率超过95%；40℃时达到100%的致死率。

对于金黄色葡萄球菌，致死率曲线的变化趋势与细菌一致，亦是在20℃时最低。当温度低于20℃时，随温度升高，致死率逐渐下降；当温度大于20℃时，随着温度升高，致死率逐渐上升；到30℃以后趋势变缓；在35℃时达到100%的致死率。

超高压处理乳制品应该在适当温度范围内进行。在低温条件下，超高压处理易导致细胞因冰晶析出而加剧破裂，蛋白质会对高压更加敏感而容易发生变性，微生物的细胞膜结构也受到损伤，这些都导致了微生物耐压性降低，而且在一定范围内温度越低，对微生物的损伤也越严重[31-32]；这就是图3中温度越低、致死率越高的原因。在较高温度范围内，温度与超高压的处理效果有协同作用[33]，适当的提高温度，可降低处理压强，亦可达到同样的灭菌效果。升温改变了微生物细胞膜的流动性，减弱了那些连接生物大分子非共价键之间的作用力，从而加速了高压处理微生物的灭菌效果，使得致死率随着温度的升高而增大[34]。超高压的灭菌效果优于热处理的灭菌效果，且在保留乳品原有特性方面优于热处理[35]。

综上，选择30、35和40℃进行下一步的正交实验。

2.4 超高压处理牛初乳对微生物致死条件的优化

由表2中菌落总数的相关数据，分析k值可知，最优组合为A3B3C3，即为550MPa、40℃、25min；由极差分析结果可知：RA＞RB＞RC，因此上述三个影响因素对微生物灭菌效果的作用大小顺序为：压强大小＞施压温度＞保压时间；对金黄色葡萄球菌的相关数据值可知，A、B、C各自三个水平中只有第一个水平数比较低，另外两个水平的作用效果是一致的，即A1＜A2=A3，B1＜B2=B3，C1＜C2=C3。而且极差分析的结果显示：压强、温度、时间这三个因素对于超高压杀灭金黄色葡萄球菌的作用效果是一致的。

因此，由正交表分析可得，超高压处理牛初乳最优组合为A3B3C3，即为550MPa、25min、40℃，经验证在此条件下，菌落总数和金黄色葡萄球菌的致死率均为100%。但在实验中，其他致死率达到了100%的条件亦为优化条件：A3B1C3、A3B2C1、A1B3C3、A2B3C1、A3B3C2，即：550MPa、30℃、25min，550MPa、35℃、15min，450MPa、40℃、25min，500MPa、40℃、15min和550MPa、40℃、20min。

3 结论

单因素压强组的实验中，在一定范围内，随着处理压力的增大，菌落总数和金黄色葡萄球菌的致死率曲线均呈上升趋势。但当压力超过一定范围后继续增大，则对杀菌效果影响不大；施压温度对杀菌效果也有显著的影响，温度过低或过高都会促进超高压对菌落总数和金黄色葡萄球菌的杀灭作用；保压时间也影响超高压处理对微生物的杀灭效果。延长保压时间，会提高菌落总数和金黄色葡萄球菌的致死率，但时间超过一定范围后则对灭菌效果没有明显的贡献。

表2 超高压处理牛初乳对微生物致死条件的优化结果Table 2 Conditions optimization results of microbial fatality rate in bovine coloctrum processed by UHP

增大压强、延长保压时间、提高施压温度均会增强超高压处理对菌落总数和金黄色葡萄球菌的致死率。超高压处理牛初乳的正交优化条件为：当压力为450MPa时，施压温度≥40℃，保压时间≥25min；当压力为500MPa时，施压温度≥40℃，保压时间≥15min；当压力为550MPa时，施压温度≥30℃，保压时间≥25min或施压温度≥35℃，保压时间≥15min。

综上所得，本研究采用超高压技术杀灭牛初乳中的微生物，处理后牛初乳中菌落总数和金黄色葡萄球菌残存很少，甚至未检出，处理效果较好，可以为牛初乳饮品的生产提供参考。

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