A N N-G A法优化石吊兰素提取工艺

张尊凯，侯 敏，权宇彤，曹家铭，董 媛，刘 艳

（吉林大学生命科学学院，吉林长春130012）

石吊兰素是广泛存在于苦苣苔科（Gesneriacee）吊石苣苔属植物吊石苣苔（Lveicnotus pauciflorus Maxin）叶和花中的黄酮类物质[1]，又名岩豆素，内华依瓦菊素。石吊兰素在植物体中以游离形式存在或与糖结合成甙的形式存在[2]。有显著的抗结核杆菌、抗炎、降压、清除自由基等多种生物学效应[3]。由于石吊兰素化学结构上含有酚羟基，所以使其具有弱酸性[4]，进而对石吊兰素的提取方法多是利用其物理化学特性。石吊兰素不溶于水，微溶于甲醇、乙醇。2010版中国药典中采用甲醇超声提取石吊兰素[5]，也有报道采用乙醇回流提取石吊兰素[2]。而对于石吊兰素提取工艺的研究却非常少。盛卫国等采用正交设计优化了石吊兰素的提取工艺[6]，不过正交实验最终优化值只能是实验所用水平的组合，不是非常准确。人工神经网络（artificial neural network，ANN）和遗传算法技术（genetic algorithm，GA）的发展，二者结合后，能够很好的解决这一问题，也越来越多的用于各种生物学仿真建模和优化过程[7]。Guo等采用ANN-GA法优化了乳链菌肽发酵培养基，使乳链菌肽产量提高了8倍[8]。基于遗传算法的神经网络模型是以网络节点模拟复杂的大脑神经细胞，同时模拟自然进化过程搜索最优解的方法，直接以逼近度（Da）作为评价指标，进行多元非线性分析[9]，比传统的优化方法更直观，适用性更广。本文根据石吊兰素的理化性质，在单因素实验的基础上，采用Box-Behnken实验设计和ANN-GA法考察了其最佳提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

石吊兰全草 河北省安国市健仁药材有限公司；石吊兰素对照品 上海纯优生物科技有限公司，纯度大于98%；甲醇 色谱纯；其余试剂 均为分析纯。

TWCL-T型电热套 巩义市宏华仪器设备工贸有限公司；Agilent 1200 Series型高效液相色谱仪 广州尚准仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 石吊兰素的提取 取烘干至恒重的石吊兰药材粉20g，置圆底烧瓶中回流提取，加入一定体积的提取液煮沸，提取1～3h，并重复1～3次。合并提取液，蒸干乙醇，并用95%乙醇定容至25mL，得样品溶液。

1.2.2 HPLC法检测石吊兰素的含量[5]

1.2.2.1 色谱条件 Agilent ZORBAXSB-C18（5μm，4.6mm×250mm）色谱柱，流动相：甲醇∶水（68∶32），检测波长334nm，柱温26℃，流速1.0mL/min，进样量20μL。

1.2.2.2 对照品溶液制备 精密称定石吊兰素对照品适量，加甲醇制成25μg/mL的溶液，即得。

1.2.2.3 标准曲线的制备 分别取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，甲醇定容至5mL，混匀后HPLC测定石吊兰素含量，并绘制标准曲线。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 乙醇浓度对石吊兰素提取量的影响 称取石吊兰样品适量，置圆底烧瓶中回流提取，按照固液比10∶1，加入体积分数浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇，煮沸，提取1h，重复两次，合并提取液，蒸干乙醇，并用95%乙醇定容至25mL，测定样品中石吊兰素含量。

1.2.3.2 提取时间对石吊兰素提取量的影响 称取石吊兰样品适量，置圆底烧瓶中回流提取，按照固液比10∶1加入95%乙醇，煮沸，分别提取0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5h。重复2次，合并提取液，蒸干乙醇，并用95%乙醇定容至25mL，得样品溶液。

1.2.3.3 固液比对石吊兰素提取量的影响 称取石吊兰样品适量，置圆底烧瓶中回流提取，分别按照固液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35加入95%乙醇，煮沸，提取1h，重复两次，合并提取液，蒸干乙醇，并用95%乙醇定容至25mL，测定样品中石吊兰素含量。

1.2.3.4 提取次数对石吊兰素提取量的影响 称取石吊兰样品适量，置于圆底烧瓶中回流提取，按照固液比10∶1加入95%乙醇，煮沸，提取1h，分别重复1、2、3、4次，合并提取液，蒸干乙醇，并用95%乙醇定分别定容至25mL，测定样品中石吊兰素含量。差较大。但是，当隐含层节点数过多时，特别容易出现网络过拟和现象[10]。而逼近度函数能很好的解决隐含节点和网络的拟合情况。逼近度函数如下：

表1 BBD实验因素水平表Table 1 Independent variables and their levels in the Box-Behnken design

式中，MSEc和MSEt分别是训练集和测试集均方根误差，nc和nt分别是训练集和测试集数据个数，n是训练集和测试集个数之和，c是常数（本文中c为1.2）。

1.2.6 GA优化 采用GA优化中适应度（Fitness）函数对最适ANN模型进行优化[9]，Fitness函数如下：

1.2.7 验证实验 为进一步确定最佳提取条件，根据ANN-GA预测的最佳提取条件进行实验，测定石吊兰素含量，重复5次，计算平均值。

2 结果与分析

2.1 单因素实验优化石吊兰素提取条件

以石吊兰素浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=0.031X+0.19533，R2=0.9993。

2.1.1 乙醇浓度对石吊兰素含量的影响 乙醇浓度与石吊兰素提取量的关系如图1所示。乙醇浓度对石吊兰素提取有显著影响，由图1可以看出，随着乙醇浓度的提高，提取液中石吊兰素的含量逐渐增加，当乙醇浓度为90%时达到最大值，此后，提取液中石吊兰素含量下降，分析认为石吊兰素的极性与90%浓度的乙醇最为接近，所以当乙醇浓度为90%时，其提取率最大。

1.2.4 Box-Behnken实验设计 根据单因素实验结果，采用4因素3水平的Box-Behnken中心组合实验设计，获得最佳提取工艺，因素水平表见表1。

1.2.5 ANN模型的建立 通过Matlab 2010a软件建立ANN模型[7]。ANN模型包括输入层、隐含层和输出层。以表2中提取条件为输入值，以石吊兰素含量为输出值。并将输入层随机分成训练集、校正集、测试集。隐含层对ANN模型的影响较大，一般情况下，隐含层节点数越多，ANN网络模拟非线性的能力就越强，隐含层节点数过少，则网络不能充分反映输入节点与输出节点间的复杂函数关系，从而导致测试误

2.1.2 提取时间对石吊兰素含量的影响 提取时间对提取液中石吊兰素含量的影响如图2所示。随着提取时间的延长，提取液中石吊兰素的含量逐渐增加，2h后，增加速度放缓，并在2.5h时，提取率达到最大，之后提取率随着提取时间的延长略有下降，说明提取液中石吊兰素接近饱和。所以选择最适的提取时间为2.5h。

2.1.3 固液比对提取液中石吊兰素含量的影响 固液比对提取液中石吊兰素含量的影响的影响如图3所示。固液比对石吊兰素的提取影响不大，不过考虑到固液比值较小时，增加了石吊兰素提取过程中的能耗和原料，不利于工业化生产，所以选择最适的固液比为1∶15。

2.1.4 提取次数对提取液中石吊兰素的影响 提取次数对提取液中石吊兰素的影响如图4所示，当提取次数为2次时，提取液中石吊兰素含量最高，且含量不会随着提取次数的增加而提高，说明提取2次时，石吊兰中的石吊兰素已经最大程度的提取出来，提取量并不会随着提取次数增加而提高。所以选择最佳的提取次数为2次。

2.2ANN-GA优化结果

按照Box-Behnken中心组合实验设计进行实验，实验结果如表2所示。随后，以表2中提取条件为输入值，以石吊兰素含量为输出值。建立ANN-GA模型优化石吊兰素提取含量。

表2 4因素3水平BBD实验设计表格Table 2 The design matrix generated for the BBD and the obtained response values

逼近度函数Da能够反映模型值和真实值的接近程度，所以Da值越大，则该隐含节点就越接近真实情况。由图5可见，当隐含节点数为17时，Da达到最大值，所以选择的ANN模型的隐含节点数为17。此时，模型的R2值为0.9853，表明ANN模型是显著的。ANN模型建立后，采用GA优化该模型，由图6可见，当进化至20代时，Fitness函数达到最低水平，且随着进化代数的增加，Fitness并没有增加。表明模型的拟合度是符合要求的。最终得到石吊兰素最大提取率为2.395mg/g。此时，对应的石吊兰素提取条件为：乙醇浓度84%，提取2.8h，固液比1∶17，提取2次。按照该条件进行5次验证实验，得到提取液中石吊兰素含量为2.35mg/g，与预测值误差为1.88%。与盛卫国等[7]优化的提取工艺相比，提取次数减少，提取时间有所延长，石吊兰素的提取量显著提高。可见，相比于正交优化法，ANNGA优化的模型拟合度更好，具有更好的优化能力。

3 结论

在单因素实验的基础上，采用ANN-GA法优化了石吊兰中石吊兰素的提取条件，不仅最大程度上提高了石吊兰素的提取率，同时也降低了能耗和成本。目前为止，关于石吊兰素提取优化的报道还很少，本文为石吊兰素在工业上的应用提供了研究基础，具有很广阔的应用前景。

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