膜型凋亡诱导配体脱落可能参与肺腺癌对TRAIL耐受

李 妍，王月华，金 宏，陈 爽，张慧锋，赵良中，李 瑶，李文平，张 铎，齐 玲综述，曹慧玲审阅

(吉林医药学院:1.检验学院，2.实验中心，3.药学院，4.基础医学院，5.科研学术处，吉林 吉林 132013)

肿瘤坏死因子相关凋亡配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL)选择性、高效地诱导多种肿瘤细胞凋亡［1］。继重组人TRAIL蛋白(recombinate human TRAIL，rhTRAIL)、抗死亡受体5(death receptor 5，DR5)单抗进入临床Ⅰ、Ⅱ期后，转染TRAIL基因抗肿瘤也完成了临床前研究，并克服了前两种制剂半衰期短的缺点［2］。虽然多数肺腺癌(adenocarcinoma，ADC)对转染 TRAIL基因耐药，但TRAIL高效、低毒的优势推动我们不断研究耐药机制、探索增敏策略［3］。

1 诱骗受体导致TRAIL耐受

三聚体的 mTRAIL(或 sTRAIL)与 DR4、DR5在细胞膜处组装死亡诱导信号复合物(death inducing sig naling complex，DISC)，再募集、活化下游分子来传递凋亡信号;而诱骗受体1(decoy receptor 1，DcR1)、DcR2或骨保护素(osteoprotegerin，OPG)竞争结合TRAIL阻断凋亡信号(图1)［3］。以 A549为代表的DR4、DR5和 DcR1阳性 ADC对 TRAIL高度耐受［4-5］。DISC信号在胞浆内传递的通路有多个环节参与TRAIL抵抗，包括c-FLIP、Bcl-2和NFκB相关的抗凋亡信号活化等，相关机制相对清晰。DcR1、DcR2对DISC组装抑制是产生耐药的上游环节，但对其影响DISC组装、参与TRAIL抵抗的机制，尚有待深入探究。

图1 TRAIL和TRAIL的受体

脂筏(lipid raft)是细胞膜内富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域，可选择性地募集磷脂酰基醇(glycosyl phosphatidyl inositol，GPI)所锚定的分子和其他类型的跨膜分子。三聚体TRAIL和三聚体DR4(DR5)结合后，被募集到脂筏内才能组成有功能的DISC(图2)。DcR1通过GPI锚定于细胞膜，在未结合TRAIL前已稳定结合在脂筏中，而DR4、DR5和DcR2分布在脂筏外［6］。TRAIL与DR4结合后向脂筏内迁移，但脂筏内DcR1竞争结合TRAIL，并将DR4排出到脂筏外。DcR1胞浆区无“死亡结构区域(death domain，DD)”，因此不能募集 FADD形成有功能的 DISC。DcR2可在脂外筏外可成同源三聚体，与DR4或DR5竞争结合三聚体化的TRAIL，由于胞浆区DD不完整，DcR2-TRAIL复合体可转入脂筏但不能募集下游信号分子［7］。近年发现，DcR2与DR5可形成异源三聚体或多聚体，然后与TRAIL三聚体结合，(DcR2-DR5)-TRAIL复合体也转入脂筏，但与 DcR2结合Caspase-8不能活化。(DcR2-DR5)-TRAIL因同时消耗TRAIL和caspase-8，对DR5组装DISC形成较强的抑制效应［7］。

图2 TRAIL和DR4(DR5)在脂筏内组装DISC

2 sTRAIL诱导细胞凋亡的活性减弱

膜型和可溶型凋亡诱导配体(TRAIL、TNF和FasL)诱导细胞凋亡的能力存在差异，通常可溶型分子诱导细胞凋亡的活性弱［8-9］。FasL是TNF超家族中与TRAIL同源性最高的成员，淋巴细胞表面的mFasL主要由去整合素金属蛋白酶10(a desintegration and metalloproteinase，ADAM10)酶切，抑制 ADAM10则减少 sFasL释放，促进 mFas诱导细胞凋亡［10］。虽然活化免疫细胞释放的sTRAIL，可结合肿瘤细胞的DR4和DR5，导致caspase-8活化，但其诱导凋亡能力弱于 mTRAIL［10］。除 mTRAIL可组装DISC外，sTRAIL及包含了N端119～241位氨基酸的多种长度的rhTRAIL也可组装DISC诱导敏感的靶细胞凋亡，但其活性也低于mTRAIL［8-9］。近年发现，sTRAIL和mTRAIL活性差异与细胞是否表达DcR1有密切联系。DcR1与TRAIL结合的亲和力高于 DR4，DcR1可与 DR4竞争结合 rhTRAIL或sTRAIL，阻止有 DISC组装。即使 DR4结合的rhTRAIL迁移入脂筏内，也可能被DcR1“抢夺”，并由DcR1将 DR4“排挤”出脂筏，研究发现，表型为DR4+、DR5+、DcR1+、DcR2-的 A549 细胞对 rhTRAIL高度耐受［4-5］。DcR1通过该机制对 sTRAIL和rhTRAIL抑制不仅被体外研究证实，临床实践中也发现DR4和DcR1阳性结肠癌对TRAIL诱导凋亡高度耐受［11］。

3 MMP-2参与mTRAIL的酶切、脱落

mTRAIL是281个氨基酸所组成Ⅱ型跨膜蛋白，分子量为32 500，其N端241个氨基酸位于胞膜外，跨膜区和胞浆区分别为26和14氨基酸［2］。病毒感染、肿瘤、自身免疫病等疾病情况下，血清中24 000 sTRAIL含量增加［12-13］。在体外以细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)及干扰素(interferons，IFNs)等刺激细胞，活化的中性粒细胞、淋巴细胞和肿瘤细胞也可释放sTRAIL［13-16］。TRAIL 是 TNF 超家族发现较晚的成员，新近才证实金属蛋白酶家族成员参与TRAIL的酶切脱落。广谱金属蛋白酶抑制剂1，10-菲咯啉(1，10-phenanthroline)和ADAM10抑制剂TAPI-1(tumor necrosis factor-alpha protease inhibitor-1)可显著抑制IFN-α诱导的结肠癌细胞释放 sTRAIL，同时上调mTRAIL表达［15-16］。Secchiero等进一步证明，基质金属蛋白酶2(metrics metalloproteinase-2，MMP-2)也参与人 mTRAIL 的酶切，并释放24kDa的 sTRAIL［17］。

4 跨膜分布的mTRAIL参与细胞膜脂筏形成

免疫细胞主要以内源表达的mTRAIL杀伤肿瘤和病毒感染等靶细胞，肿瘤细胞的mTRAIL也可通过与自身或相临细胞DR4、DR5组装为DISC，诱导凋亡［16-18］。N端119～241位氨基酸是 TRAIL与受体结合的功能区;其中230位Cys残基(Cys230)参与该分子与二价锌离子螯合，稳定形成具有活性的同源三聚体。研究发现，细胞表面mTRAIL需先组装为三聚体才能向脂筏内迁移，而其在脂筏内与DR5结合还参与脂筏结构的稳定，跨膜分布的mTRAIL促进细脂筏内DISC的形成［19］。sTRAIL也具有形成DISC的功能，但sTRAIL不具备跨膜区，缺少了mTRAIL稳定脂筏子内DISC的功能。理论而言，抑制MMP-2对mTRAIL的酶切，可能促进mTRAIL-DR5在脂筏内组装DISC，从而增强凋亡信号的转导，克服对DcR1阳性肿瘤细胞对TRAIL的耐受。

5 低浓度姜黄素对MMP-2的抑制作用

姜黄素(分子式为C21H20O6，分子量368.4)是取自姜黄属植物根部的活性成分，具有治疗炎症、抗肿瘤和抗纤维化等药理作用［20］。姜黄素以活性氧(reactive oxygen species，ROS)依赖途径抑制胰腺癌、肝癌、乳腺癌和肺癌等肿瘤增殖，IC50值为 50～100 μmol/L［21］。近年来，低浓度(≤50 μmol/L)姜黄素非ROS依赖途径抗肿瘤的机制陆续被发现［22］。主要包括:①抑制组蛋白去乙酰基酶(histone deacety lases，HDACs);②通过上调p21和p27表达而抑制细胞周期运行;③通过抑制NFκB而下调细胞周期素到D1(cyclin D1)和癌基因c-myc表达;④抑制磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycinm，mTOR)途径，使其下游抗凋亡、促增殖的靶基因表达下降等。在美国，姜黄素治疗胰腺癌已进入临床Ⅱ期，其在预防结肠癌方面的研究也日益被重视。此外，姜黄素下调与肿瘤转移密切相关的多种蛋白，包括表皮生长因子受体、血管内皮生长因子、MMP-2、MMP-3和 MMP-9等。新近发现，25～50 μmol/L姜黄素可抑制肝星状细胞株对明胶的水解，从而降低其迁徙和侵袭，即姜黄素抑制MMP-2水解细胞外胶原蛋白［23］。

目前，姜黄素是否抑制MMP-2酶切mTRAIL还未见报道。我们在前期工作中发现，5～20 μmol/L姜黄素以非ROS依赖的方式上调mTRAIL跨膜分布，并增强A549对TRAIL基因转染所诱导的凋亡。低浓度姜黄素可能通过抑制MMP-2来抑制sTRAIL释放，促进mTRAIL跨膜分布和DISC组装，从而增强TRAIL诱导DcR1阳性肺腺癌凋亡。若要阐明姜黄素抗肿瘤的新药理作用，尚需要参照如下技术路线深入开展研究，用实验数据回答如下问题(图3):①低浓度姜黄素上调TRAIL跨膜分布是否与其抑制MMP-2的酶切有关?②跨膜TRAIL增加是否促进脂筏内DISC组装?③姜黄素与TRAIL联合是否促进DcR1阳性肺腺癌细胞凋亡信号的转导?

图3 研究膜型分子脱落参与肺腺癌对TRAIL耐药的技术路线

mTRAIL和sTRAIL均可结合死亡受体，但膜结合型分子还参与脂筏内由DR4/DR5所组装DISC的稳定性。因此，阐明膜结合型TRAIL脱落的机制、证实姜黄素的新药理作用可能为提高肺腺癌对TRAIL治疗的敏感性提供新策略。

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