穿蛭膏对实验性兔膝关节骨质增生细胞因子的影响

欧阳瑾，曹志友，王新成，王冬梅，唐锐先 (吉林医药学院直属医院，吉林吉林 132013)

骨质增生症［1］又称骨刺、骨关节炎或骨关节退行性病变，中医辨证里属“痹证”的范畴，近年来已成为中老年人的常见病、多发病。中药复方制剂治疗该病的实验室研究也成为近年来的热门，随着分子生物学、细胞生物学的发展，从细胞分子水平来研究防治该病的作用机制也越来越多。穿蛭膏是王振会老中医在继承祖传的基础上，经过几十年临床实践研制而成的治疗骨质增生的中药方剂，该方着眼治本，多以补肝肾、益精壮骨为主，辅以祛风除湿散寒，活血化癖通络，在实践中取得了满意的疗效。本研究利用兔膝关节骨质增生症模型对一氧化氮(NO)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平的检测，探讨穿蛭膏的作用机制，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康7～8月龄日本大耳白兔28只，雌雄各半，重2.5～2.7 kg(平均2.6 kg)，由吉林医药学院动物实验中心提供。

1.2 药物与试剂

穿蛭膏处方由阿魏、甲珠、三七、水蛭、乳香、徐长卿等十余味中药组成［2］，以上药物均购于吉林大药房，由吉林医药学院药学院制成膏药备用。骨质增生一贴灵，批号:豫卫健用字(2003)第0229号，香港现代国际药业集团有限公司生产。

美国酶标仪MK3型，3K30型低温高速离心机(美国sigma公司)，上海电热恒温水箱，分光光度计等。

NO试验盒由南京生物建成公司生产，IL-1β酶联免疫检测试剂(批号:0510132)、TNF-a酶联免疫检测试剂(批号:肠10118)(以上试剂均购于北京鼎国生物技术服务有限公司)均为进口分装。

1.3 兔膝关节骨质增生模型及分组

参考经典Hulth手术造模方式，每兔耳缘静脉注射戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉后，固定在手术台上，选左膝无菌条件下施行手术，显露膝关节，切除内侧半月板并切断内侧后韧带后逐层缝合切口。为了预防感染可适当给予抗生素，7 d后切口基本长好，可每日驱赶白兔2次，每次30 min，4周后模型完成。

模型完成后，将兔随机分成3组，每组7只，模型组不作任何处理;穿蛭膏组用穿蛭膏(0.52 g/每贴)贴敷患侧膝关节，每2 d换药1次;骨质增生一贴灵组用骨质增生一贴灵(0.51 g/每贴)贴敷患侧膝关节，每2 d换药一次。治疗8周，于最后一次治疗完毕后，采用耳缘静脉空气栓塞法处死3组动物。

1.4 标本取材及检测

按造模切口打开膝关节，肉眼观察并记录膝关节面软骨情况，切除胫骨干和内侧股骨髁表面的软骨，甲醛固定，EDTA液脱钙，常规脱水，浸蜡包埋，5 μm切片，HE及甲苯蓝染色，观察软骨形态、组织结构、细胞数量和损伤程度，并采用Mankin法［3］对关节软骨组织进行评分。每兔耳缘静脉取血，分离血清，-20℃保存备检。关节液标本采集按毕氏［4］等介绍的关节冲洗液抽取方法，获得4组兔膝关节冲洗液，回收量为0.4～0.6 mL，平均0.5 mL，于-20℃低温冰箱中保存待测。

采用硝酸还原酶法检测NO含量;用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELIsA)检测 IL-1β、TNF-a含量。以上均严格按试剂盒上方法进行检测。

1.5 观察指标

肉眼观察关节面平整、粗糙、裂隙、糜烂等，色泽正常、灰暗，软骨剥脱，软骨下骨暴露，纤维性增生及边缘是否有骨赘形成等。镜下观察软骨组织结构、软骨细胞数量和软骨损伤程度。

染色观察关节软骨的变化并行Mankin's评分，Mankin's评分标准［5］见表1。检测外周血中及关节冲洗液中 IL-1β、TNF-α、NO 含量。

1.6 统计学方法

采用SPSS12.5统计软件包进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

肉眼可见正常对照组，表面完整、光滑、色泽正常，无缺损及新生物;模型对照组，表面明显粗糙、肥厚、中度糜烂、外露的软骨下骨破坏，骨松质暴露;骨质增生一贴灵组，表面粗糙、关节面有小裂隙，关节面溃疡，滑膜色泽暗红;穿蛭膏组，表面略显粗糙，尚完整，有些轻度糜烂，色泽灰暗。

镜下各组关节软骨Mankin's评分结果，正常对照组0.3±0.3，模型对照组8.4±1.7，骨质增生一贴灵组6.2±1.5、穿蛭膏组4.8±1.4;正常组与其他3组有显著性差异(P＜0.01);模型组与两治疗组有显著性差异(P＜0.01);穿蛭膏组与骨质增生一贴灵组有显著性差异(P＜0.05)。说明这两组对关节软骨的病理损伤均有不同程度的减轻，穿蛭膏作用更明显。

各组血清及关节液中IL-1β、TNF-α、NO见表2和3。由表2可知，穿蛭膏与骨质增生一贴灵均能显著降低实验性兔膝骨关节骨质增生模型血清中IL-1β、TNF-α、NO 的含量(P ＜0.05，P ＜0.01)，穿蛭膏组与骨质增生一贴灵组比较差异不明显(P＞0.05)。

由表3可知，穿蛭膏组关节液中IL-1β、TNF-α和NO与模型组、正常对照组和骨质增生一贴灵组比较均有显著性差异(P＜0.01，P＜0.05)，说明穿蛭膏可明显降低兔膝关节骨质增生模型关节液中IL-1β、TNF-α、NO 的水平。

3 讨论

骨质增生是由风寒湿长期侵袭作用，加上受压、劳损等刺激引起的骨和骨关节慢性病变。病变初始只产生一些炎性细胞因子，继而在细胞因子的刺激诱导下软骨细胞功能减退、软骨基质的分解加速、软骨组织的磨损，逐渐导致骨质破坏，主要表现为关节软骨面破坏，软骨下骨质硬化，进而继发滑膜症和关节周边的骨质增生或骨刺形成。

表1 关节软骨镜下Mankin's评分标准

表2 各组血清中 IL-1β、TNF-α、NO 检测分析(s，n=7)

表2 各组血清中 IL-1β、TNF-α、NO 检测分析(s，n=7)

与正常组比较*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较#P＜0.05，##P＜0.01;与骨质增生一贴灵组比较﹠P＜0.05

组 别 IL-1β(ng/mL)TNF-α(ng/mL)NO(μmol/mL)0.46±0.04 9.33±4.28 79.37±24.41模型对照组 0.98±0.08＊＊ 38.24±11.47＊＊ 107.46±32.19*骨质增生一贴灵组 0.56±0.05＊＊# 27.62±7.05＊＊## 56.25±22.34*#穿蛭膏组 0.49±0.07#﹠ 23.58±9.14＊＊## 48.34±23.21*#正常对照组

表3 各组关节液中IL-1β、TNF-α、NO检测分析(s，n=7)

表3 各组关节液中IL-1β、TNF-α、NO检测分析(s，n=7)

与正常组比较*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较#P＜0.05，##P＜0.01;与骨质增生一贴灵组比较﹠P＜0.05

组 别 IL-1β(ng/mL)TNF-α(ng/mL)NO(μmol/mL)0.21±0.09 1.52±0.31 43.56±18.62模型对照组 0.53±0.06＊＊ 2.97±0.34＊＊ 74.36±27.13*骨质增生一贴灵组 0.39±0.05＊＊## 2.29±0.22＊＊## 49.44±29.37#穿蛭膏组 0.32±0.07＊＊##﹠ 2.11±0.24＊＊##﹠ 42.82±25.32正常对照组#

NO为一种自由基气体，是一种生理和病理生理介质［6］。本实验中模型组与正常对照组在血清和关节液中NO都有显著性差异(P＜0.05)，说明在此病变过程中，NO在炎性因子等的刺激下水平升高。Grrabowski认为［7］，在关节内炎性介质(IL-1β)诱导下，软骨母细胞中的诱导型NO(iNOS)合成被激活，产生大量的NO。有报道称［8］该病患者血清及滑膜液中NO含量增高，与本实验结果相符。一般认为，NO在骨关节炎中的产生是一系列的连锁反应，炎性细胞因子可诱导出高水平的NO，NO抑制软骨基质中的蛋白多糖和Ⅱ型胶原，抑制软骨细胞增殖，激活金属蛋白酶和环氧合酶，促进胶原降解并使前列腺素E2(PGE2)水平上升，造成了对关节软骨的破坏。

细胞因子［9］(cytokine)是一类由造血系统、免疫系统或炎症反应中的活化细胞产生的具有高活性多功能的多肽、蛋白质或糖蛋白。目前研究发现，IL-1β、TNF-α是重要的细胞因子，在机体的炎症反应、免疫应答、物质代谢和生长发育、胚胎发生等多个方面发挥重要作用。TNF-α能选择性地抑制软骨胶原的产生，抑制蛋白聚糖的合成，同时促其降解，与软骨破坏及滑膜炎有一定关系［10］，TNF-α在发病中与IL-1β起着协同作用。IL-1β、TNF-α的存在，能引发滑膜炎症和细胞因子介导关节软骨的破坏［11］。IL-1也是最经典的炎症调节剂，有IL-1α和 IL-1β两种亚型。有学者报道培养膝关节滑膜细胞后，其上清液有IL-1主要以IL-1β为主，IL-1β是关节软骨破坏的最重要的一种炎性细胞因子［12］。研究证实［13］人类关节中的软骨母细胞，只要加入炎性细胞因子如IL-1β、TNF-α等，就会导致软骨自身组织的损伤。

本实验穿蛭膏组方中阿魏消积，散痞、疏风、活血;甲珠通经、消肿、活络;乳香、没药活血止痛，消肿生肌;三七化瘀止血，活血定痛;瓦楞子消痰积，散血块;徐长卿疏风解热，行气活血;水蛭通经，破瘀消肿。上药合用，具有软坚化骨，舒筋活络，祛风除湿，止痹痛等功效。

可见穿蛭膏治疗骨质增生的作用与散风驱寒祛除湿热，疏通筋络，行气活血有关，体现的是中医整体的治疗观。本研究中穿蛭膏通过抑制IL-1β、TNF-α等炎性细胞因子，同时抑制iNOS被激活，减少NO的产生，从而减轻软骨组织的损伤，达到抑制软骨细胞凋亡，阻止软骨基质降解、修复或延缓关节软骨退变作用，说明穿蛭膏有抗氧化和清除自由基等作用，以减轻它们对关节软骨的损害。另一方面也增强了机体免疫功能，稳定了关节内环境而起到了关节软骨的保护作用。

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