乳腺癌淋巴管密度的临床病理意义

张云虹 王小玲

淋巴道转移是癌症的主要死亡原因之一，它是预后不良的重要危险因素，也是确定治疗方案和手术方式的重要指标。乳腺癌是我国女性常见的恶性肿瘤之一，淋巴管是乳腺癌细胞转移到腋窝淋巴结的主要途径。淋巴管和血管伴行生长，但在结构和功能方面却有着明显不同，以前对肿瘤淋巴管的研究由于缺乏特异性的淋巴管内皮标记物而远滞后于对肿瘤血管的研究。新近发现的抗M2A的单克隆抗体D2-40能高度特异性的标记淋巴管内皮细胞［1，2］。本文通过免疫组化法研究D2-40标记的乳腺癌淋巴管的病理学特征，定量分析D2-40阳性微淋巴管密度，探讨其在乳腺癌淋巴结的转移中的临床意义及其与其他病理参数之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集衡水市第二人民医院2008年5月至2011年8月乳腺癌患者术后组织石蜡标本50例，另选取同期乳腺纤维腺瘤标本30例作为对照组。患者均为女性，年龄28～78岁，中位年龄45岁。50例中，其中浸润性导管癌41例，浸润性小叶癌6例，导管内癌2例，黏液腺癌1例。有淋巴结转移的30例，无淋巴结转移的20例。肿瘤直径0.6～8 cm，平均2.6 cm。病理分级：Ⅱ级7例，Ⅱ～Ⅲ级22例，Ⅲ级12例。临床分期：Ⅰ期的8例，ⅡA期的22例，ⅡB期的17例，ⅢA期的3例。所有病例术前均未接受放化疗，均有完整的临床病理资料。

1.2 试剂及免疫组化方法 主要试剂鼠抗人D2-40免疫组化单克隆抗体，金·多聚赖氨酸粘附玻片，UltrasensitiveTMSP超敏试剂盒(鼠/兔)，DAB显色试剂盒，PBS磷酸盐缓冲液(粉剂);柠檬酸盐抗原修复液(粉剂)均由福州迈新生物技术开发有限公司提供。免疫组化方法：石蜡切片4μm厚，放入烤箱烤蜡3 h;常规二甲苯、梯度酒精脱蜡至水;柠檬酸盐抗原修复液高温修复;切片依次滴加过氧化物酶阻断试剂，正常非免疫动物血清，第一抗体D2-40，生物素标记的第二抗体，链霉素抗生物素蛋白—过氧化物酶试剂;切片上滴加新鲜配制的DAB显色试剂显色;自来水冲洗终止显色，苏木素复染，中性树胶封固。

1.3 免疫组化结果判断 D2-40特异性的定位于淋巴管的内皮细胞，以胞浆或胞膜呈现清晰的棕黄色颗粒为阳性表达。D2-40标记的微淋巴管密度的判定采用Fox等［3］报道的方法先在低倍镜下(×100)选取脉管数目最多的2个“热点”，然后在高倍镜(×400)下观察每个热点的5个视野，计数其脉管数目，但应除外管腔直径＞8个红细胞或管壁有平滑肌存在的脉管，最后再计算2个热点，5个视野的平均脉管数目。

1.4 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，组间计量资料均数比较采用t检验，相关性分析采用person相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 D2-40标记的良恶性乳腺组织中的淋巴管形态特征及分布 D2-40阳性的淋巴管内皮细胞的胞浆或胞膜内可见棕黄色颗粒。光镜下D2-40染色阳性的淋巴管具有不规则形状，由单层内皮细胞排列而成，有空隙，无厚壁结构，管腔中无红细胞。乳腺癌癌周组织内淋巴管较丰富，管壁薄，管腔扁大(图1)，可有较多皱褶，可见脉管瘤栓(图2);周围乳腺组织内淋巴管也较多，管壁也很薄，管腔大且扩张(图3);乳腺癌中心区淋巴管少且小，管腔狭窄(图4)，甚至呈条索状，发育差;乳腺纤维腺瘤中的淋巴管也少，管腔狭小(图5)，乳腺肌上皮细胞D2-40也呈阳性表达(图6)。

图1 乳腺癌癌周组织内淋巴管丰富，管壁薄，管腔扁大(SP×100)

图2 乳腺癌癌周组织内淋巴管扁大扩张，可见脉管瘤栓管(SP×100)

图3 周围乳腺组织内淋巴管丰富，管壁薄，管腔大且扩张(SP×100)

图4 乳腺癌中心区淋巴管数量少，管腔小且狭窄，其中一管腔内可见淋巴细胞(SP×100)

图5 乳腺纤维腺瘤中淋巴管数量少，管腔狭小(SP×40)

图6 乳腺纤维腺瘤中导管肌上皮细胞D2-40染色阳性(SP×40)

2.2 乳腺癌癌周、乳腺周围及中心区的微淋巴管密度比较50例乳腺癌中有38例D2-40阳性，30例乳腺纤维腺瘤中有10例D2-40阳性，2组阳性率(38/50，10/30)相比差异有统计学意义(U=3.241，P＜0.05)。乳腺癌癌周组织微淋巴管密度为8.60～33.50个，平均(21±6)个;乳腺癌中心区微淋巴管密度为4.20～13.67个，平均(6±4)个;周围乳腺组织微淋巴管密度为7.13～25.80个，平均(17±8)个;乳腺纤维腺瘤微淋巴管密度为5.30～12.50个，平均为(7.2±2.4)个。乳腺癌癌周区微淋巴管密度明显高于中心区和纤维腺瘤组，差异有统计学意义(t=16.09，P ＜0.05;t=12.01，P ＜0.05)。周围乳腺组织的微淋巴管密度明显高于中心区和纤维腺瘤组，差异有统计学意义(t=14.67，P ＜0.05;t=10.23，P ＜0.05)。乳腺癌癌周的微淋巴管密度明显高于周围正常乳腺组织的微淋巴管密度，差异有统计学意义(t=7.92，P＜0.05)。乳腺癌中心区的微淋巴管密度和乳腺纤维腺瘤组比较差异无统计学意义(t=0.704，P=0.488)。

2.3 乳腺癌癌周、周围乳腺及中心区的微淋巴管密度与临床病理参数之间的相关性 乳腺癌癌周和周围乳腺组织的微淋巴管密度与肿瘤的大小，临床分期及淋巴结转移情况密切相关(P ＜0.05)，与患者的年龄、组织学分型及 ER、PR、C-erbB2、Ki-67、VEGF、P53等临床病理参数无明显相关性(P ＞0.05)。乳腺癌中心区的微淋巴管密度与这些临床病理参数无明显相关性(P ＞0.05)。见表1～3。

3 讨论

恶性肿瘤中血道和淋巴道转移是肿瘤细胞转移的重要途径，而肿瘤细胞的转移和侵袭又是癌症患者死亡的重要原因之一。乳腺癌早期以淋巴道转移为主，因而对肿瘤淋巴管的研究也就显得尤为重要。但由于缺少特异性的淋巴管内皮细胞标记物，对肿瘤淋巴管的研究一直滞后于对肿瘤血管的研究。以前报道过的淋巴管内皮标记物有血管内皮生长因子-3(VEGFR-3)，淋巴管内皮细胞透明质酸受体-1(LYVE-1)，Podoplanin等［4］，但在以后的研究中发现这些标记物的特异性都较差，因而制约了对肿瘤淋巴管的研究。新近发现的D2-40是一种抗M2A癌胚膜抗原的IgG2a型的鼠来源的单克隆抗体，其标记淋巴管内皮细胞的特异性和敏感性均高于其他的淋巴管内皮标记物。目前大部分的研究结果证实了D2-40能高度特异的标记正常和肿瘤组织中的淋巴管内皮细胞，可用于免疫组化检测冷冻和石蜡包埋组织病理切片中的淋巴管内皮细胞，并且可以检测多种恶性肿瘤的淋巴管侵袭［1，2］。

表1 乳腺癌癌周LMVD与临床病理参数的相关性

表2 周围乳腺组织LMVD与临床病理参数的相关性

表3 乳腺癌中心区LMVD与临床病理参数的相关性

本研究通过对50例乳腺癌和30例乳腺纤维腺瘤的微淋巴管的标记和计数发现乳腺癌组织周边及离癌组织较远的正常乳腺组织内都存在较多的淋巴管，且乳腺癌周边的淋巴管密度较正常乳腺组织内的淋巴管密度高。癌组织周边及离乳腺癌组织较远的正常乳腺组织内的淋巴管管壁薄，管腔扁且大，可见较多皱褶，乳腺癌中心区组织内也存在一些淋巴管，但数量很少且管腔小，发育差，有的甚至闭锁呈条索状，这与一些学者的观点是一致的［5］。乳腺纤维腺瘤组织中也存在一些淋巴管，但数量远较乳腺癌周边及离乳腺癌组织较远的正常乳腺组织内的少，且管腔小，与文献报道［6］一致。同时在研究微淋巴管密度与乳腺癌组临床病理参数时发现乳腺癌周边及周围乳腺组织内的微淋巴管密度和淋巴结的转移情况，肿物的大小，临床分期密切相关，而与患者的年龄、组织学分型及 ER、PR、C-erbB2、Ki-67，VEGF，P53等临床病理参数无明显相关性，可能与标本量较小有关。

乳腺癌在早期是以淋巴结转移为主的，在肿瘤细胞发生淋巴结转移之前，它必须先进入淋巴管。乳腺癌组织周边及远离癌组织的正常乳腺组织中的淋巴管数目的增加可以增加淋巴管的表面积，进而使肿瘤细胞更容易入侵，淋巴管数目的增加以及淋巴管腔的扩张，又导致了淋巴管密度的增加，这可能是肿瘤淋巴道转移的形态学基础及LMVD增加的机制［6］。淋巴管的增生及扩张为癌细胞向淋巴结的转移提供了便利的途径，所以研究乳腺癌的淋巴管密度的临床病理意义对探讨淋巴管的生成机制具有一定的价值，并且可以对乳腺癌预后的判断以及抗淋巴结转移的治疗提供理论和实验依据。

1 Yonemura Y，Endou Y，Tabachi K，et al.Evaluation of lymphatic invasion in primary gastric cancer by a new monoclonal antibody，D2-40.Hum Pathol，2006，37：1193-1199.

2 Takanami I.Lymphatic microvessel density using D2-40 is associated with nodal metastasis in non-small cell lung cancer.Oncol Rep，2006，15：437-442.

3 Fox SB，Leek RD，Weekes MP，et al.Quantitation and prognostic value of breast cancer angiogenesis：comparison of microvessel density，Chalkley count，and computer image analysis.JPathol，1995，177：275-283.

4 张海娥，庄建基，杨帆.恶性肿瘤淋巴管生成与转移的研究进展.第四军医大学学报，2007，28：479-480.

5 谢晓冬，屈淑贤，郑振东，等.人乳腺癌中D2-40标记的微淋巴管密度与淋巴结转移关系的研究.中国肿瘤临床，2008，35：810-813.

6 许丙辉，薛亚静，李恒力，等.乳腺癌淋巴管密度与血管内皮生长因子相关性分析.河北医药，2011，33：1775-1777.