一株犬种布鲁氏菌的分离与鉴定

2013-10-09周桂兰李旭妮程君生丁家波毛开荣韦海涛薛水玲祝俊杰

中国兽药杂志 2013年2期

周桂兰，李旭妮，吴启，程君生，王楠，丁家波，毛开荣，韦海涛，薛水玲，祝俊杰

(1．北京市畜牧兽医总站，北京 100107;2．中国兽医药品监察所，北京 100081)

犬种布鲁氏菌是布鲁氏菌属的一个种，主要引发犬类动物发生布鲁氏菌病［1］，也可以与牛种、羊种、猪种布鲁氏菌合并引发犬的布鲁氏菌病(布病)［2］。患病母犬的主要临床症状是流产，产弱仔，产道炎;患病公犬精液中可携带布鲁氏菌和大量炎症细胞及病变精子，部分病犬出现附睾炎和睾丸萎缩等炎症病变［3］。2012年2月，从贵宾犬的前肢静脉血中培养分离到疑似布鲁氏菌，经过血清学试验、生化试验、PCR试验鉴定确定该菌种是犬种布鲁氏菌，将该菌株命名为Brucella canis GB1。

1 材料

1．1 血样来源无菌采血样品来自北京一居民家养流产贵宾犬，该犬第一次发情与自家公狗交配，顺利产下4只健康幼犬。第二次发情与他人养的一只贵宾犬交配，怀孕51 d后发生流产。该病犬流产后的第115天体表温度达38．9℃，眼睛有大量脓性分泌物，对其前肢静脉采血，从全血中分离得到该菌。分离血清保存于－20℃。

1．2 菌株对照用菌株牛种布鲁氏菌A19(CVCC 70202)、羊种布鲁氏菌 M28(CVCC 70003)、犬种布鲁氏菌RM6/66(CVCC 70701)、猪种布鲁氏菌S2(CVCC 70502)均由中国兽医药品监察所提供。

1．3 血清及抗原犬种布鲁氏菌阳性血清(对RM6/66抗原凝集效价为1∶4096)由课题组研制;布鲁氏菌阳性血清(批号:201001)与阴性血清(批号:2001－1)、布鲁氏菌病虎红平板凝集试验抗原(批号:201201)、布鲁氏菌病试管凝集试验抗原(批号:201201)，均由中国兽医药品监察所提供。

1．4 培养基胰眎琼脂培养基由中国兽医药品监察所制备。胰酶大豆培养基(TSB)为BD/Difco产品(批号:0144388)。

1．5 试剂 PH8．9 Menzel’s缓冲液(蒸馏水1000 mL、Na2CO30．795 g、NaHCO37．14 g、NaCl5 g、苯酚5 g)、石炭酸生理盐水。

1．6 试剂盒细菌基因组DNA提取试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司(Lot:CA1301);PCR反应试剂盒(Lot:DR001B)、DNA Marker DL2000(Lot:D501A)，TAKARA 公司。

2 方法

参照世界卫生组织的文献［4］，对该菌进行分离培养及鉴定。

2．1 细菌的分离、培养特性和生化试验

2．1．1 细菌培养试验犬采血后立即全血接种胰眎琼脂斜面培养基，37℃培养72 h。

2．1．2 菌体、菌落染色将培养后的菌体涂抹于玻璃片上，火焰固定后革兰氏染色，油镜观察。用布鲁氏菌菌落结晶紫染色液对菌落染色15 s后观察。

2．1．3 生化试验将醋酸铅滤纸条放入增殖的待

检菌样品中，37℃培养72 h，观察结果。

2．2 凝集试验

2．2．1 布鲁氏菌虎红平板凝集试验试验血清作1∶1、1∶2、1∶6 倍稀释，分别取 30 μL 与布鲁氏菌病虎红平板凝集试验抗原30μL混合反应，4 min后观察结果，出现凝集颗粒，液体完全透明记为++++;有明显的凝集颗粒，液体几乎完全透明记为+++;有较明显的凝集颗粒，液体稍透明记为++;稍能见到凝集，液体混浊记为+;无凝集，液体均匀混浊记为－。

2．2．2 试管凝集试验

2．2．2．1 比浊对照管配制 1∶20稀释抗原等量稀释液稀释(1∶40稀释)后，再用稀释液配制成含1∶40抗原0%、25%、50%、75%、100%的悬液。分别代表:菌体完全凝集和沉淀，液体100%清亮记为++++;菌体几乎完全凝集和沉淀，液体75%清亮记为+++;有显著的凝集和沉淀，液体50%清亮记为++;有清楚的凝集和沉淀，液体25%清亮记为+;无凝集和沉淀，液体均匀混浊记为－。

2．2．2．2 犬种布鲁氏菌病试管凝集试验抗原用pH8．9 Menzel’s缓冲液作 1 ∶20 稀释;被检血清及阴、阳性对照血清用 pH8．9 Menzel’s缓冲液作1 ∶12．5 、1 ∶25、1 ∶50、1 ∶100 倍稀释。

2．2．2．3 稀释好的抗原和各稀释度被检血清(第1管加入0．1 mL混合后弃0．25 mL，第2管从第1管取0．5 mL加入混合后弃0．5 mL，第3管从第2管取0．5 mL混合后弃0．5 mL，第4管从第3管取0．5 mL混合后弃0．5 mL)及阴、阳性对照血清各加0．5mL混合，置37℃温箱中作用24 h，取出与比浊对照管比较读取结果。

2．3 细菌的AMOS－PCR鉴定

2．3．1 菌株复苏和细菌基因组的提取牛种、羊种、犬种和猪种布鲁氏菌菌种复苏时，用胰眎琼脂划线，于37℃培养箱中培养72 h。各挑取单个菌落到1．5 mL TSB液体培养基中，37℃培养至对数生长中期，按照Qiagen细菌基因组抽提试剂盒说明书，提取各细菌基因组DNA，经初步定量的核酸置－20℃保存备用。

2．3．2 引物设计参照已发表的文献［5－6］，设计表1所示的各引物。其中RIS711存在于IS711基因内，不同的F引物则对应于IS711基因外侧。将Fabortus、Fmelitensis、Fsuis配成引物混合储存液(简称AMS引物)，每种引物浓度为25μmol/L，其他各引物的储存浓度均配制成25μmol/L。

表1 用于鉴定布鲁氏菌种属的PCR引物序列

2．3．3 PCR反应体系 50μL的反应体系中，含5μL 10× Buffer;8μL 2．5mmol/L dNTPs;AMS引物混合物2 μL，RIS711、Feri、Reri储存液各2 μL;Taq 酶2U，模板DNA 1μL(或用接种环蘸取少量菌体)。

2．3．4 PCR反应程序经过优化的PCR反应程序为:95℃ 5min后，按94℃ 1min，60℃ 1．5min，72℃ 1．5min进行28个循环;最后72℃延伸10min。扩增产物用1．5% 琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。

3 结果与结论

3．1 细菌的分离、培养特性和生化试验全血接种2个胰眎琼脂斜面培养基后共培养出8个呈乳白色、圆形、凸起的菌落，经过细菌的分离、培养特性观察和生化试验，对菌体革兰氏染色后，放在显微镜1000倍油镜下观察:菌体呈细小球状，呈红色(阴性)，菌落经结晶紫染色后呈紫色，无 H2S产生，初步诊断分离的该流行菌株为布鲁氏菌属犬种。

3．2 凝集试验病犬血清样品粗糙型布鲁氏菌病虎红平板凝集试验结果呈阳性反应(+)，详见表2;病犬血清样品粗糙型布鲁氏菌病试管凝集试验结果也呈阳性反应(+)，详见表3。病犬血清样品光滑型布鲁氏菌凝集试验均呈阴性反应(－)，本项血清学试验诊断结果证明了该病犬感染了粗粗糙型布鲁氏菌。

表2 粗糙型布鲁氏菌病虎红平板凝集试验结果

表3 粗糙型布鲁氏菌病试管凝集试验结果

3．3 AMOS － PCR 鉴定结果 A19、M28、S2 和RM6/66均在划线接种后72 h均出现可见的小菌落，本研究中的分离菌培养72 h同样形成肉眼可见的菌落，比其它光滑型布鲁氏菌形成的菌落稍大。单个菌落接种TSB液体培养基，37℃摇振培养20 h后，提取基因组DNA。取2μL进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下均能观察到特异性条带。PCR产物电泳结果见图2。该项试验进一步证明了本次分离的菌株为犬种布鲁氏菌。