鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗的安全性和免疫效力试验

刘淑红，焦铁军，李河林，2，白 军，2，王运宏，黄建斌，张娟娟，渠淑华

(1．杨凌绿方生物工程有限公司，陕西杨凌 712100;2．西北农林科技大学动物医学院，陕西杨陵 712100)

禽流感(Avian influenza，AI)和新城疫(Newcastle disease，ND)均可引起多种家禽及鸟类发病，被世界动物卫生组织列为A类传染病。目前我国AI的流行以低致病性H9亚型为主，该亚型病毒虽然很少引起发病和死亡［1］，但在继发或并发感染ND病毒等病原的情况下，仍可引起禽类的高发病率和高死亡率;H9亚型AI病毒与ND病毒还可以跨越种属屏障直接感染人［2－4］，因此对这两种疾病的研究，具有重要的经济和公共卫生意义。

目前，一般采用疫苗接种来预防这两种传染病，为有效控制这两种疾病的发生与流行，本试验以从患病鸡中分离到的H9亚型AI病毒 SY株和ND病毒La Sota株为种毒研制了二联灭活疫苗，现将该疫苗的安全性和免疫效力试验结果报告于下。

1 材料与方法

1．1 疫苗 新城疫、禽流感(H9亚型，SY株)二联灭活疫苗(简称二联苗)，由杨凌绿方生物工程有限公司研发中心实验室制备，批号为090325。

1．2 实验动物 SPF雏鸡:SPF种蛋由北京梅里亚维通实验动物有限公司供应，自行孵化出雏后置负压隔离器内饲喂至所需日龄。产蛋鸡:6月龄罗曼蛋鸡，杨凌某鸡场。

1．3 禽用负压隔离器 黑龙江灵鼠科技开发有限责任公司生产。

1．4 病毒及检验试剂 H9亚型AI病毒SY株，108．5EID50/0．1mL，由本实验室保存;鸡新城疫血凝抑制试验抗原，中国兽医药品监察所;禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原，哈尔滨维科生物技术开发公司。

1．5 安全性试验

1．5．1 SPF雏鸡安全性试验 将28日龄 SPF鸡随机分为7组，每组10只，第1、2组分别以肌肉注射和皮下注射的方式接种二联苗0．5 mL;第3、4组分别以肌肉注射和皮下注射的方式接种二联苗1．0 mL;第5、6组分别以肌肉注射和皮下注射的方式接种二联苗0．5 mL，2周后以相同方法再次接种二联苗0．5 mL;第7组不免疫作为对照。所有试验鸡接种后观察21 d，并在免疫后21 d进行剖检。

1．5．2 产蛋鸡安全性试验 将6月龄产蛋鸡分为7组，每组30只，第1、2组分别以肌肉注射和皮下注射的方式接种二联苗0．5 mL;第3、4组分别以肌肉注射和皮下注射的方式接种二联苗1．0 mL;第5、6分别以肌肉注射和皮下注射的方式接种二联苗0．5 mL，2周后以相同方法再次接种二联苗0．5 mL;第7组不免疫作为对照。接种后1个月内观察试验鸡有无局部或全身不良反应;并统计鸡群最后一次接种后1个月内的产蛋率。

1．6 免疫效力试验

1．6．1 血清抗体检测 将30日龄SPF鸡随机分成3 组，每组30 只，第1、2 组分别按 0．3、0．5 mL/只的剂量接种二联苗;第3组不免疫作为对照。从每组试验鸡中随机抽取10只，在接种前及接种后不同时间采血，分离血清，分别测定ND HI、AIHI抗体效价。

1．6．2 免疫攻毒试验 将上述试验鸡于免疫后7、14 d随机抽取10只，分别静脉注射AI病毒SY株病毒液0．2mL(含108．0EID50)，并于攻毒后第5 天，按照文献［5］中方法对试验鸡进行病毒分离。

1．7 HI抗体检测 参照GB/T 17999．2－2008进行。

2 结果

2．1 安全性试验结果

2．1．1 SPF雏鸡安全性试验结果 28日龄SPF鸡以不同的接种方式无论单剂量、超剂量还是单剂量重复接种二联苗后，所有试验鸡精神、食欲、粪便等均正常，未见任何不良反应，第21天剖检可见接种部位无炎症、无结节，疫苗吸收良好。

2．1．2 产蛋鸡安全性试验结果 6月龄蛋鸡接种不同剂量二联苗后，精神状态良好，采食饮水正常，粪便等未见异常;免疫后1个月内免疫鸡的产蛋率略低，与对照鸡相比，相差0．24% ～1．07%(表1)。

表1 二联苗免疫后1个月内试验鸡的产蛋率

2．2 免疫效力试验结果

2．2．1 抗体检测结果 结果见表2、表3、图1、图2。

表2 ND病毒HI抗体检测结果

表3 AI病毒HI抗体检测结果

从图中可看出，免疫后7 d，试验鸡均检测到ND、AIHI抗体，但抗体水平较低，免疫后14 d时产生较高水平的抗体;免疫后5周内，抗体水平逐渐升高并达到峰值，高峰期时抗体几何平均值ND HI≥1 ∶1024，AIHI≥1 ∶891;此后抗体逐渐下降，0．3 mL组试验鸡免疫二联苗后20周，HI抗体降至临界水平，ND HI几何平均值为1∶23，AIHI几何平均值为1∶119，而0．5 mL组试验鸡免疫二联苗后其HI抗体水平至免疫后30周才降至临界水平;在整个试验期间，第1组试验鸡产生的HI抗体始终低于第2组，而对照鸡的HI抗体均处于阴性水平。2．2．2 攻毒试验结果 见表4。疫苗免疫后7 d攻击AI病毒SY株，免疫鸡病毒分离率超过6/10，免疫后14 d攻毒免疫鸡，病毒分离率为0。

表4 SPF雏鸡免疫后攻击AI病毒SY株后病毒分离结果

3 讨论

由于AI病毒一直存在变异与进化，在试验前期用近几年分离到的H9N2亚型毒株进行了“二联苗接种SPF鸡后对H9亚型AI病毒流行毒株的攻毒保护试验”，结果表明，以早期分离的毒株制备的疫苗可以抵抗近几年分离到的H9亚型AI病毒的攻击，这与目前我国众多学者［6－7］的研究结果相一致。而传统的疫苗株ND病毒La Sota株对目前流行的ND强毒亦具有很好的交叉保护性［8］。因此，选用AI病毒SY株和ND病毒La Sota株作为制苗毒株制备二联灭活苗。

安全性试验结果表明，二联苗以皮下注射和肌肉注射的方式超剂量免疫SPF小鸡后，试验鸡未见异常，说明二联苗安全性良好;二联苗以不同的接种方式超剂量免疫6月龄罗曼蛋鸡后，免疫鸡产蛋率与对照鸡相比略有下降(月产蛋率下降不超过1．07%)，考虑到疫苗免疫引起的应激反应亦可引起试验鸡产蛋率的下降，故认为疫苗本身对产蛋鸡的生产性能影响不大。说明二联苗对雏鸡与产蛋鸡均是安全的。

根据李慧姣［9］、唐秀英［10］等的研究结果，ND HI抗体效价与抗攻毒保护成正相关，当ND HI≥1∶16，攻毒保护率可达86．7%以上;AIHI抗体效价≥1∶64时，对H9亚型AI病毒的攻毒保护率可达100%。该二联苗接种试验鸡后2周ND HI抗体几何平均值不低于1∶128，AIHI抗体几何平均值不低于1∶74，攻击AI病毒SY株病毒液后病毒分离率为0。免疫后20周，ND HI抗体几何平均值不低于1∶23，AIHI抗体几何平均值不低于1∶119，因此，二联苗的免疫期至少可持续20周。

［1］ 万晓朋，曾显营，田国彬．H9N2亚型禽流感流行株灭活疫苗种毒的筛选［J］．中国预防兽医学报，2010，32(4)︰276－280．

［2］ 郭元吉，李建国，程小雯．禽 H9N2亚型流感病毒能感染人的发现［J］．中华实验和临床病毒学杂志，1999，13(2)︰105－108．

［3］ 李 靖，刘伯华，祝庆余．禽流感病毒跨种属感染人的机制研究进展［J］．微生物学通报，2005，32(3)︰121 －124．

［4］ 陈丽颖，王亚宾，张红英，等．幼鸽暴发新城疫及其对人感染报告［J］．中国人兽共患病学报，1999，15(5):113 －117．

［5］ 刘丽平，焦新安，张小荣．减毒沙门菌运送的H9N2亚型禽流感病毒DNA疫苗的研制及其免疫试验［J］．动物医学进展，2007，28(9)︰1 －6．

［6］ 景小冬，章振华，李 林，等．H9亚型禽流感病毒流行毒株交叉免疫攻毒保护试验［J］．中国畜牧兽医，2010，37(6)︰134－137．

［7］ 童海兵，张小荣，吴艳涛，等．H9N2亚型禽流感病毒的遗传进化分析及F株灭活疫苗的免疫效果评价［J］．中国预防兽医学报，2010，32(12)︰933 －936．

［8］ 王友令，徐怀英，李 莉，等．新城疫La Sota疫苗对不同基因型流行株的免疫保护［J］．浙江农业学报，2009，21(5)︰446－449．

［9］ 李慧姣，蒋桃珍，李启红，等．鸡新城疫灭活疫苗免疫攻毒试验与血清学(HI)试验的平行关系研究［J］．中国兽医杂志，2004，38(8):5 －8．

［10］ 唐秀英，付朝阳．重新审视禽流感［J］．中国家禽，2001，23(12)︰7－9．