猪细小病毒HA、HI微量法试验的优化

张婉华，邹 勇，朱永军，彭丽英，张春玲，蒋凤英，何锡忠，倪建平

(上海佳牧生物制品有限公司，上海 201106)

猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病因之一，可引起母猪尤其是初产母猪的繁殖障碍，表现为母猪受胎率降低，产活仔数减少和(或)出现死胎、木乃伊胎等［1］。PPV具有凝集红细胞的特性，尤其是对豚鼠和人O型红细胞。由于人的O型红细胞来源受限，因此豚鼠红细胞在实验室诊断中应用较多。血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HI)是PPV抗原、抗体检测的常用方法之一，也是PPV抗原、抗体检测最为经典的方法［2－5］。1986年潘雪珠等建立了试管法，获得了较为满意的结果［6］，但试验操作及洗涤较为麻烦，且试剂及检测样品用量大。本实验室建立了“U”型微量板HA、HI试验，但由于红细胞悬液浓度偏低，判断结果往往要等很长时间。本试验研究了不同红细胞悬液浓度、不同液体体积、不同形状微量板对猪细小病毒HA、HI试验的影响。

1 材料与方法

1．1 微量板 96孔“U”型微量板和96孔“V”型微量板(底角为90°)。

1．2 抗原及抗体 PPV阴性血清、阳性血清、抗原、67份HA检测样品，29份HI检测样品，本公司研发中心提供。

1．3 试剂 Alsever液、pH7．4磷酸缓冲液(PBS)、pH7．2磷酸缓冲液(含Ca2+、Mg2+)、25%白陶土悬液，均按常规方法配制，116℃15min灭菌，4℃保存。

1．4 豚鼠红血球的配制 采集健康豚鼠血液，按常规方法配制成不同浓度的红细胞悬液。

1．5 HA试验 96孔“U”微量板和“V”微量板，分别采用100μL和50μL液体体积。试验方法参考文献［5］，略作改进。豚鼠红细胞悬液分别采用0．25%、0．5%和 1%的浓度。

67份样品，通过不同浓度的豚鼠红细胞悬液，在“U”型和“V”型微量板上进行平行试验，比较二者差异。以“U”型微量板、0．25%豚鼠红细胞悬液浓度获得的结果为判定标准。

1．6 HI试验

1．6．1 血清的处理 29份血清56℃水浴灭活30 min。经25%白陶土液和25%豚鼠红血球悬液处理，收集上清液作为原始血清的1∶8稀释液。

1．6．2 HI试验 96孔“V”型微量板和“U”型微量板，分别采用25μL和50μL液体体积。试验方法参考文献［5］略作改进。豚鼠红细胞悬液浓度为0．5%。每次测定时设立阳性血清对照、阴性血清对照、抗原对照和红细胞对照。

29份血清样品，在“U”型和“V”型微量板上进行平行试验，比较二者差异。以“U”型微量板、0．25%浓度的豚鼠红细胞悬液获得的结果为判定标准。

2 结果与分析

2．1 HA试验 67份样品在“V”型微量板和“U”型微量板上同时测定HA抗原效价。结果在“U”型和“V”型微量板上用浓度0．25%和0．5%的豚鼠红细胞悬液，所获得的结果差异不明显，但在“V”型微量板获得的结果更清晰;用1%浓度的红细胞悬液，结果与标准结果差异很大(表1)。

表1 “U”型和“V”型微量板上不同浓度红细胞悬液不同液体体积的HA试验结果

2．2 HI试验 结果见表2。29份血清在“V”微量板和“U”微量板上同时测定HI抗体效价，结果用0．5%浓度的红细胞悬液与标准结果差异不明显，但作用时间明显缩短，且“V”微量板上获得的结果更清晰、更易判断。

3 结论

PPV感染诊断方法有多种，但最常规、最经典的HA、HI检测方法基本可满足常规的病原检测和血清流行病学调查的需要。本研究通过对不同浓度的豚鼠红细胞悬液进行比较试验，发现提高豚鼠红细胞悬液的浓度，由原来的0．25%提高到0．5%，用50μL体积进行HA试验，用25μL体积进行HI试验，在“V”型微量板上的试验结果更清晰、更易判断。

［1］ 殷 震，刘景华．动物病毒学［M］．第二版．北京:科学出版社，1997．

［2］ 朱润芝，陈溥言，芦银华，等．猪细小病毒病诊断研究进展［J］．中国动物检疫，2005，22(4):44 －46．

［3］ 蒋玉雯，冯 军，黄安国，等．猪细小病毒的流行病学调查［J］．中国兽医杂志，1990，(3):7 －9．

［4］ 刘艳华，范伟兴，王锡乐．猪细小病毒的研究概况［J］．中国畜牧兽医，2004，31(12):45 －48．

［5］ 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1919－2007．猪细小病毒病红细胞凝集抑制试验操作规程［S］．

［6］ 潘雪珠，唐骐骏，叶向阳，等．用血凝抑制试验检测猪细小病毒抗体［J］．上海畜牧兽医通讯，1985，(4):13 －15．

表2 “U”型和“V”型微量板上0．5%红细胞悬液不同液体体积的HI试验结果