肺炎球菌荚膜多糖对人体免疫应答状态的初步研究

李圆菲，郑晓斌，周文英，黄 瑾＊

（1．长沙市中心医院 重症医学科，湖南 长沙410008；2．中山大学附属第五医院，广东 珠海519000）

肺炎球菌一直是全球范围肺部感染最常见的致病菌，占社区获得性肺炎的第一位，肺炎链球菌肺炎是引起成年人CAP（Community Acquired Pneumonia，社区获得性肺炎）最常见的病因，被认为是人类的重要致病菌，波及范围极广，在欧洲和美国占需住院CAP患者的30%－50%［1］，在我国年龄大于60岁的老年人中为33．4%，儿童占38．2%［2－3］。严重危害人类健康。肺炎球菌为革兰阳性双球菌，荚膜多糖为其主要的致病因子，根据其荚膜不同的组成成分，定义出91种血清型。PPV23（Pneumococcal Polysaccharide Vaccine 23，23价荚膜多糖肺炎球菌荚膜多糖疫苗），这种疫苗是0．5ml中包括了23种血清型提纯的肺炎球菌荚膜多糖，这23种血清型为1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、20、22F、23F和33F，每种血清型25μg，这些血清型涵盖了美国和其他一些发达国家成年人侵袭性肺疾病的85%－90%，并包括了大多数耐药血清型［1］。覆盖了我国71．9%的分离肺炎球菌菌株的血清型［4］。其广泛推荐在有某些对肺炎球菌易感因素的成年人和大于2岁的儿童中使用，这些因素包括有慢性心、肺、肝脏等疾病。

不同人群在自然状态下对肺炎球菌应答情况及应答过程中产生抗体量的情况目前暂不完全清楚。本研究通过间接酶联免疫试验检测人体血清中的抗肺炎球菌荚膜多糖IgG，IgM，了解健康人群、CAP患者在自然状态下免疫应答的水平。

1 资料与方法

1．1 研究对象 实验中CAP患者，健康对照组血液标本为2010年8月至2012年3月我院呼吸内科就诊患者，采血均知情同意，健康人组为同期我院体检科体检自愿者。健康人组男13名，女17名，平均年龄为（39．77±5．89）岁。纳入研究的CAP组包括男19名，女13名，平均年龄为（46．28±22．2）岁。CAP诊断：（1）符合CAP的诊断标准：符合中华医学会2006年制定的CAP诊断和治疗指南［5］；（2）排除标准：孕妇；明确或高度怀疑肺结核患者；支气管扩张、间质性肺疾病等原发肺基础疾病。

1．2 标本采集和实验室参考血清制备 用促凝管抽取血液约4ml，在离心机中以3 000转／分，离心5分钟，取血清封装于高压灭菌的离心管中，保存于－70℃冰箱中备用。将50名等量健康人血清混匀制成实验室参考血清。实验过程中探测疫苗最佳包被浓度、最佳血清稀释度等分装于灭菌安瓿中－70℃保存。

1．3 主要仪器及试剂 酶标仪（BIO－TEK INSTRUMENTS．INC公司）；96孔ELASISA聚苯乙烯板（广州威佳生物公司）；23价肺炎球菌多糖疫苗（纽莫法，美国默沙东公司）；小牛血清白蛋白（BSA，杭州四季清公司）；辣根过氧化酶标记羊抗人IgG（北京博奥森生物技术有限公司）；辣根过氧化酶标记羊抗人IgM（武汉博士德生物工程有限公司）；H2O2／TMB底物（北京万泰生物药业有限公司）；包被缓冲液（PBS）；洗涤液：0．05%Tween20磷酸盐缓冲液（PBST）；抗体缓冲液：含1%BSA 的0．05%Tween磷酸盐缓冲液（PBST）。

1．4 研究方法 本实验主要根据WHO发布的关于《ELISA法定量测定抗肺炎球菌荚膜多糖血清特异性IgG 抗体培训手册》（Training mannual for Enzyme Linked Immunosorbent Assay for the quantitation of Streptococcus pneumoniae serotype specific IgG Pn PS ELISA）［6］及根据本实验室条件采用间接酶联免疫吸附实验。通过棋盘滴定得出检测不同类型抗体最佳抗原包被浓度、血清稀释倍数及酶标二抗浓度。

1．5 统计学处理 应用SPSS17．0统计分析软件进行数据处理。各组计量资料以均数±标准差（¯x±s）表示。组内比较采用t检验，P＜0．05被认为在统计上有显著性差异。

1．6 结果记录

结果中记录OD值为复孔算术平均值与最高空白对照值的差，最高空白对照值控制在0．01以下。每块酶标板以实验室参考血清稀释倍数及相应OD值做拟合曲线，R2为0．990±0．003，以拟合方程计算结果，以样本血清抗体浓度相对参考血清的抗体浓度的比值来表示结果。

2 结果

CAP患者抗肺炎球菌荚膜多糖特异性免疫球蛋白IgM高于健康人，但P值为0．109，两者在统计学上无显著差异。CAP患者抗肺炎球菌荚膜多糖特异性免疫球蛋白IgG高于健康人，在统计学上有显著性差异（P＜0．01），见表1。

表1 各组血清抗肺炎球菌荚膜多糖IgM、IgG值

3 讨论

肺炎球菌荚膜多糖抗原为TI抗原，进入机体后在48小时内，即与B1细胞表面的BCR结合，通过受体交联使后者活化，分化成抗体分泌细胞，并迅速分泌IgM抗体，直接或通过补体经调理作用清除病原体。IgM是初次体液免疫应答中最早出现的抗体，血清检出IgM提示新近发生感染。

肺炎球菌荚膜多糖为TI－2抗原，其免疫应答机制尚未完全阐明。普遍认为，TI－2抗原存在大量重复抗原表位，能激活补体旁路途径和凝集素途径，刺激成熟B1细胞和边缘区B细胞。TI－2抗原表位与BCR相应位点结合，提供第一信号，同时通过其重复性抗原表位使BCR发生交联，提供第二信号，从而激活B细胞，应答过程不需T细胞的辅助。一般认为，针对TI－2抗原的应答只产生IgM抗体，不发生Ig类别转换，也不产生记忆性B细胞。但也有证据显示，T细胞的辅助可以增强B细胞对TI－2抗原的应答，并诱导抗体类别转换，这一过程与Th细胞激活释放的某些细胞因子有关，这些细胞因子作用于B细胞后不仅增强抗体应答，且促进抗体类别转换［7］。

本研究提示，CAP患者在感染初期抗肺炎球菌IgM抗体水平明显升高，这与相关文献报道社区获得性肺炎常见病原菌为肺炎球菌相符［8］。健康人血清存在一定量的抗肺炎球菌荚膜多糖IgM抗体，其值总体偏低，可能与肺炎球菌定植有关。在一般情况下，机体对肺炎球菌存在一定的抵抗力，当机体抵抗力下降、免疫抑制及病原菌异位时就会引起机体感染。

本研究结果表明，健康人血清中存在抗肺炎球菌荚膜多糖IgG抗体，且在健康人群中其浓度符合正态分布，提示人体感染肺炎球菌是一种普遍现象，或人体在自然状态下能对寄生状态下的肺炎球菌产生免疫应答，且可形成免疫记忆。这与相关文献中提到TI抗原能产生免疫记忆相一致［7］。

CAP患者抗肺炎球菌荚膜多糖IgG抗体水平高于健康人，符合再次免疫机体体液免疫应答的一般规律，即产生的抗体以IgG为主，且抗体应答迅速，峰值高。由于肺炎球菌长期定植于人体鼻咽部，CAP患者既往多次感染多种血清型肺炎球菌并可能已对本次致病的肺炎球菌产生免疫应答，形成免疫记忆，当机体再次感染同种血清型肺炎球菌荚膜多糖时即产生高滴度的IgG抗体。其特异性IgG抗体浓度高于健康人。根据机体体液免疫应答的一般规律，二次应答的能力可持续存在数个月或数年，故机体一旦感染后可持续相当时间不再感染相同病原体［9］。表明机体在自然状态下存在对肺炎球菌有较强的免疫应答能力，且TI抗原可以引起机体免疫记忆。据此可得出结论，CAP患者能在自然感染过程中产生一定量抗肺炎球菌荚膜多糖抗体，且此类抗体能持续较长时间具有保护作用，是否需要予以健康人常规进行肺炎球菌荚膜多糖疫苗接种需进一步研究。

［1］123－valent pneumococcal popysaccharide vaccine WHO position paper Weekly Epidemiological Record［OL］．2008，83：373－384 http：／／www．who．int／wer．

［2］庞小芬，吴秀琳．老年社区获得性肺炎150例临床分析［J］．现代医药卫生，2004，20（18）：1852．

［3］袁 艺，王天有，陈慧中，等．儿童院内及社区获得性肺炎病原菌和药敏试验及分析［J］．中国实用儿科杂志，2003，18（10）：623．

［4］罗小铭，胡右婵，梁建平，等．肺炎链球菌的耐药性及血清型分布调查［J］．实用预防医学，2003，10（6）：835．

［5］中华医学会呼吸病学分会．社区获得性肺炎诊断和治疗指南［J］．中华结核呼吸杂志，2006，29：651．

［6］Training mannual for Enzyme Linked Immunosorbent Assay for the quantitation of Streptococcus pneumoniae serotype specific IgG（Pn PS ELISA）．2011［1－20］［OL］．www．vaccine．uab．edu．

［7］周光炎．免疫学原理［J］．上海：上海科学技术出版社，2007：188－189．

［8］索玉洁．社区获得性肺炎病原菌及耐药性分析［J］．中国初级卫生保健，2010，24（4）：276．

［9］Hancock DB，Eijgelsheim M，Wilk JB，et al．Meta－analyses of genome－wide association studies identify multiple lociassociated with pulmonary function［J］．Nat Genet，2010，42（1）：45．