木霉REMI突变株主要生防酶活性改变及其基因部分序列差异的研究

刘 限， 孙淑清， 高增贵， 黄 哲

（1.沈阳农业大学生物科学技术学院，沈阳 110866；2.沈阳农业大学植物保护学院植物免疫研究所，沈阳 110866）

木霉具有快速生长、强产孢能力、分泌多种细胞壁降解酶（纤维素酶、几丁质酶、葡聚糖酶等）和产生抗菌物质的能力。大多数木霉都具有很强的根际或叶围竞争能力，能够降解碳水化合物、酚复合物、多聚糖和在农业上广泛使用的各种异质杀菌剂［1］。木霉的主要生防机制有重寄生［2］、抗菌物质［3］、营养竞争［4］和促进植物生长发育或诱导植物产生抗性［5］。与重寄生和营养竞争相关的酶主要包括NAGase、几丁质酶、蛋白酶、β－1，3－葡聚糖酶、转化酶和酯酶等，且不同木霉各种酶活性差异较大［6］，说明不同木霉在生防上发挥作用的机制是不同的。

限制性内切酶介导整合（restriction enzymemediated integration，REMI）技术可以用来转化真菌［7］，从而随机标记基因，并可通过PCR技术和质粒抢救等技术进行基因克隆和功能分析［8－9］，从而探索功能基因间的相互作用和基因表达差异的机理。已有研究表明，木霉REMI突变株对番茄灰霉病的防治效果存在差异，说明不同的菌株间生防活性存在差异［10］。因此本研究以木霉REMI突变株为研究对象，筛选出主要生防酶（几丁质酶和葡聚糖酶）活性改变较大的菌株，研究几丁质酶和葡聚糖酶生防酶活性的变化及其基因部分序列存在的差异，以期为阐明木霉生防活性改变的分子机制提供新思路和理论依据，也为利用转基因技术提高木霉生防活性提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：木霉菌株T21及其REMI突变株（Ttrm55、Ttrm68、Ttrm31、Ttrm94、Ttrm121、Ttrm123、Ttrm25、Ttrm76、Ttrm86），其中 REMI突变株是沈阳农业大学植物免疫研究所生物工程实验室通过REMI技术构建并保存的。

1.2 木霉与番茄灰霉病菌的对峙培养

将番茄灰霉病菌菌片（6mm）接于PDA的平板边缘，于28℃培养36h后再将转化体和出发菌株T21对接于平板对面的边缘，于28℃培养，并连续观察菌落的生长情况，培养3d后，测量灰霉病菌菌饼到菌落边缘的距离r。计算抑制率I（%）＝（R－r）／R（R为对照中未接木霉的灰霉病菌菌饼到菌落边缘的距离）。

1.3 生防酶－几丁质酶、β－1，3－葡聚糖酶活性测定

几丁质酶活性测定参照顾向阳的方法，以每毫升反应混合物中每小时在37℃pH5.2条件下生成1μg N－乙酰葡糖胺为一个酶活单位U，比活性以每mg蛋白的酶活性单位表示（U／mg Protein）［11］。

β－1，3－葡聚糖酶活性测定参照高增贵的方法，以葡聚糖为底物，根据从葡聚糖中释放出葡萄糖的量来测定酶活性［11］。

1.4 木霉不同REMI突变株与生防有关酶DNA序列间的差异

按照TRNzol试剂盒（天根）提供的方法提取木霉总RNA，检测后按照TIANScript RT Kit试剂盒提供的方法进行RNA反转录获得cDNA。然后根据GenBank中关于哈茨木霉几丁质酶和β－1，3－葡聚糖酶的基因序列设计简并引物，几丁质酶（F：5′－AAGAAGCCAACCCACTTG－3′； R： 5′－GCATAGTCATAAGCCATCAGG－3′）和β－1，3－葡聚糖酶（F：5′－GCTCTTGCTCCTGGTGGTCGTTA－3′；R：5′－CAGGGTTGTTGCCAGCCATATT－3′），建 立20μL的PCR反应体系：cDNA模板1.5μL，上下游引物各1μL，2×Taq PCR Master－mix10μL，用ddH2O补足至20μL。PCR反应程序为：（1）95℃5min预变性，1个循环；（2）95 ℃ 20s变性，β－1，3－葡聚糖酶60℃25s退火（几丁质酶54℃30s），68℃30s延伸，40循环；（3）68℃保温5min，1循环；程序结束后进入4℃状态。PCR产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，送大连宝生物公司测序。然后利用NCBI网站提供软件进行BLAST比对分析。

2 结果与分析

2.1 木霉REMI突变株对番茄灰霉病菌的抑制作用

由图1可知，不同木霉REMI株对番茄灰霉病菌的抑制作用有显著差异，其中抑制作用最强的是菌株Ttrm68，抑制率高达70.6%；其次为Ttrm34、Ttrm31、Ttrm76、T21、Ttrm25、Ttrm55、Ttrm121、Ttrm86；而Ttrm94抑制效果最差，抑制率仅达到39.2%。采用新复极差法进行数据分析，在1%水平上，木霉REMI转化体菌株与出发菌株T21的差异极显著。另外，在对峙试验中发现不同木霉REMI突变株对番茄灰霉病菌的作用方式也发生了变化，有的能够覆盖番茄灰霉病菌并在其上生长（如菌株Ttrm68、Ttrm76和Ttrm34），有的不能覆盖番茄灰霉病菌（菌株 Ttrm25、Ttrm31、Ttrm55、Ttrm121和Ttrm86及出发菌株T21）。综合分析试验结果，筛选出Ttrm68、Ttrm25、Ttrm31、Ttrm94和 T21 5株对番茄灰霉病菌作用差异较大的木霉菌株，进一步研究其主要生防酶的活性。

图1 转化体菌株对番茄灰霉病的拮抗作用Fig.1 The antagonism of different Trichoderma strains to Botrytis cinerea

2.2 不同木霉REMI突变株几丁质酶及β－1，3－葡聚糖酶的活性

5株木霉的几丁质酶及β－1，3－葡聚糖酶活性测定结果见图2。结果表明不同木霉REMI突变株产生的几丁质酶的比活性不同。各木霉REMI突变株菌株间酶活性及与出发菌株T21间均存在极显著差异。其中活性最高的为菌株Ttrm68，其次为菌株Ttrm31，菌株Ttrm94的活性最低。菌株Ttrm68及菌株Ttrm31几丁质酶的活性均高于出发菌株T21，而菌株Ttrm25及菌株Ttrm94均低于出发菌株T21。由此可见不同木霉REMI突变株的几丁质酶活性存在很大差异。不同木霉REMI突变株产生的β－1，3－葡聚糖酶的比活性不同，突变株Ttrm68活性最高，菌株Ttrm31的β－1，3－葡聚糖酶活性略低于Ttrm68，菌株Ttrm94的β－1，3－葡聚糖酶活性最低。由此可以看出通过对峙筛选出的不同木霉菌株间几丁质酶和β－1，3－葡聚糖酶活性间存在差异，可以进一步进行其基因序列差异的分析。

图2 木霉菌株几丁质酶及β－1，3－葡聚糖酶活性Fig.2 β－1，3－glucanase activity and chitinase activity of different Trichodermastrains

2.3 木霉不同REMI突变株几丁质酶和β－1，3－葡聚糖酶基因部分序列的差异比较

2.3.1 木霉菌株RNA的提取及几丁质酶和β－1，3－葡聚糖酶基因PCR产物检测

从图3可以看出28S和18S条带明亮、清晰，且28SrRNA亮度明显高于18SrRNA亮度，是其亮度的两倍多，说明RNA质量良好。以总RNA为模板反转录合成cDNA。以cDNA为模板扩增出β－1，3－葡聚糖酶和内切几丁质酶基因的部分片段，其中β－1，3－葡聚糖酶基因片段大小为448bp，内切几丁质酶基因片段大小为374bp（图4）。

2.3.2 木霉菌株几丁质酶和β－1，3－葡聚糖酶基因部分序列比较

将获得的几丁质酶基因和β－1，3－葡聚糖酶基因的部分序列测序后，分别获得有效序列为389个和280个碱基，利用Blast进行比对后发现，这5株不同木霉中，几丁质酶基因中只有突变株Ttrm31和Ttrm68在限制性内切酶SalI的酶切位点处插入了GGTATCGATATCGAC片段（图5），使其基因序列发生变化；其余2株与出发菌株T21的序列完全一致。

图5 木霉几丁质酶基因部分核酸序列Fig.5 Partial chitinase nucleotide sequences from different Trichodermastrains

由图6可以看出，突变株Ttrm31和Ttrm68在限制性内切酶SalI的酶切位点后插入了GIDID（分别是甘氨酸，异亮氨酸，天冬氨酸，异亮氨酸和天冬氨酸）5个氨基酸，使得这两个氨基酸序列发生变化。而突变株Ttrm25和Ttrm94的氨基酸序列与出发菌株T21的一致，没发生任何变化。说明REMI部分插入影响到部分木霉几丁质酶的基因，使其发生改变，进一步导致氨基酸序列发生改变。由于几丁质酶活性测定结果显示，突变株Ttrm25和Ttrm94几丁质酶活性均低于出发菌株T21，推测可能由于插入到别的功能位点使其失效或减弱，从而造成酶活降低。突变株Ttrm68和Ttrm31酶活性均比出发菌株T21的高，所以推测插入处可能为其功能位点，增强了该酶的表达，该功能位点是一重要调控位点。

图6 木霉几丁质酶氨基酸部分序列Fig.6 Partial chitinase amino acid sequences fromTrichodermastrains

5株木霉菌β－1，3－葡聚糖酶基因经 RT－PCR扩增测序比较结果如图7所示。突变株Ttrm94在限制性内切酶XhoI的酶切位点处插入了GTC；而菌株Ttrm25、Ttrm31、Ttrm68的基因序列与出发菌株T21一致，均未发生变化。

由图8可以看出，Ttrm94在限制性内切酶XhoI的酶切位点后插入了R（精氨酸），精氨酸的侧链带有一个胍基，具有亲水性，属于功能基团，而功能基团对酶的活性起着重要的调节作用，从而可能改变了该菌株的β－1，3－葡聚糖酶的活性。

3 讨论

由于限制性内切酶消化片段对染色体的插入是随机的，一旦插入于有意义序列或调控序列，则该序列控制的一系列性状将产生突变［13］。目前REMI技术主要应用于不同植物病原菌致病相关基因的研究［14－17］中，且有用于创造木霉菌株变异、筛选新生防菌株的报道［18］。本文在优化哈茨木霉T21菌株原生质制备、再生、转化条件的基础［19］上，利用REMI技术将外源质粒DNA随机插入到木霉的染色体中，从而使木霉中某些基因激活或者失活，筛选出主要生防酶活性不同的木霉REMI突变株，发现菌株间两种生防酶的活性发生了极显著的变化。几丁质酶活性提高的Ttrm68和Ttrm31菌株的酶氨基酸序列中插入了GIDID 5个氨基酸残基，在插入的氨基酸中甘氨酸的侧链较小，在许多蛋白质构象中起着独特作用；而天冬氨酸属酸性氨基酸，含有β－羧基，带负电，且经常出现在蛋白质分子表面，是构成酶的活性中心的氨基酸［19］。可能由于这些活性基团的加入，从而使酶活性升高。菌株Ttrm68的活性高于菌株Ttrm31可能由于在别的功能位点处同样插入了能提高酶活的功能基团。β－1，3－葡聚糖酶活性降低的Ttrm94菌株其酶氨基酸序列中插入了R，可能由于精氨酸插入到β－1，3－葡聚糖酶的催化部位或结合部位，使其结构也发生变化，影响其与底物结合，也可能由于极性基团的影响改变其带电状态，使酶结合结构域或催化活性中心的电荷发生变化，从而使酶活性改变［20－21］。当然或许有其他位点也发生了改变造成酶活性改变，尚待进一步的深入研究。其他菌株间酶活性变化也可能是在别处插入后导致功能位点活性提高（或）降低，这些都需要进一步对这两种酶的基因进行克隆，获得全序列进行比对和分析，同时还需要对不同菌株产生的酶进行分离纯化，研究其酶学性质来进一步探讨其变化产生原因。

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