猫豆炭疽病病原分离与鉴定

叶云峰， 付 岗， 刘 威， 蒋 妮， 刘丽辉， 胡凤云

（1.广西壮族自治区药用植物园，广西药用资源保护与遗传改良重点实验室，南宁 530023；2.广西农业科学院微生物研究所，南宁 530007）

猫豆［Mucunapruriens（Linn.）DC.］，别名刺毛黧豆、狗爪豆、猫爪豆、龙爪豆、虎爪豆等，是豆科黧豆属一年生藤本植物。猫豆在非洲、印度和加勒比均有种植，在我国主要分布于亚热带石山地区［1］。广东、广西、贵州、海南、台湾和云南等南部省区均有种植，其中，广西是猫豆的主产区，种植面积超过1 500 hm2。猫豆种子是生产治疗帕金森氏病的经典药物左旋多巴的重要原材料［2］，还含有抵抗蛇毒［3］和抗糖尿病［4］的活性成分，并具有壮阳活性，民间用于治疗性障碍［5］。此外，猫豆还具有重要的食用价值和饲料价值。目前，猫豆在广西已经形成了“种植—加工—养殖／医药化工”产业链。近年来，随着猫豆在广西种植面积的增加，出现了一些危害较重的病虫害，其中，炭疽病为主要病害，发病率为30%左右，病重地块达70%，主要危害猫豆的叶片、茎蔓和豆荚，大大降低了猫豆的产量和品质。该病在广西的龙州县、隆安县、天等县、贵港市等地均有发生。目前尚无该病病原的报道，作者对广西猫豆炭疽病病原进行分离和鉴定，以期为该病害的有效防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

患病的猫豆病株采自广西壮族自治区龙州县八角乡。对田间自然感病植株进行症状描述。

1.2 病原菌的分离纯化

选取猫豆叶片、茎蔓及豆荚的病健交界处病组织，切成0.5 cm×0.5 cm小块，用75%乙醇浸泡30 s，0.1%升汞消毒1 min，再用无菌水漂洗3次，置于PDA培养基上28℃培养，待长出菌丝后，挑取菌落边缘进行纯化，纯化后的菌落通过单孢分离获得纯培养分离物。

1.3 分离物的致病性测定

1.3.1 室内离体接种

将纯培养的分离物菌丝块通过针刺接种法接种到健康的猫豆叶片、茎秆及豆荚上，置于28℃的恒温培养箱内保湿培养，以针刺伤口处放PDA培养基块的叶片、茎秆及豆荚为对照，定期观察各组织的发病情况，发病后再对病斑进行病原菌分离。

1.3.2 田间接种

将在PDA上培养7 d的分离物配成孢子悬浮液（105个孢子／mL），喷施于田间种植的健康的猫豆叶片、茎秆及豆荚上，设刺伤和无伤口接种2个处理，以喷施无菌水的植株为对照，每处理接种20株猫豆，定期观察发病情况，发病后从病斑上再次分离病原菌。

1.4 形态学鉴定

观察病原菌在PDA平板上的菌落特征，显微观察菌丝体、分生孢子等的形态特征，对病原菌进行形态学鉴定。

1.5 分子生物学鉴定

病原菌DNA提取采用CTAB法［6］。以ITS4 5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′ 和 IT5 5′－GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG－3′为 引 物，PCR扩增菌株的ITS r DNA序列。反应在50μL体系中进行，体系含有10×Ex Buffer 5μL，d NTP（2.5 mmol／L）1μL，Primer ITS4 （10μmol／L）2μL，Primer ITS5 （10μmol／L）2μL，Genomic DNA 100 ng，ExTaq（5 U／μL）0.5μL；dd H2O 补足至50μL。反应程序为：95℃预变性5 min，进入循环，95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃复性80 s，33个循环，最后72℃延伸7 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收目标DNA片段，由北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序，测序结果用Blast软件在GenBank数据库中进行相似性比对。

2 结果与分析

2.1 病害症状

该病主要危害猫豆的叶片、茎蔓和豆荚。叶片感病后，病斑从叶尖或叶缘呈“V”字形或不规则形向叶片中间部位扩展，病斑初始为黄色，后变褐色、干枯，病斑周围黄色，病叶后期穿孔。茎蔓上的病斑初始为近圆形或不规则形褐色斑，随后朝横向和纵向扩展成黑褐色大斑，病斑稍凹陷，严重时导致茎蔓枯死。豆荚感病后在表面形成黑色近圆形或不规则形凹陷病斑，多个病斑扩大融合成片，使豆荚瘪小或生长不良，天气潮湿时，在病斑上形成粉红色黏性物（图1）。该病害在猫豆的成株期至生长后期（6月－11月）均可发生，最早在叶片上出现症状，随后感染茎蔓和豆荚。种植密度大、偏施氮肥的地块发病较重；高温多雨时期发病较重，蔓延迅速。

图1 猫豆炭疽病田间症状Fig.1 Natural symptoms of velvet bean anthracnose

2.2 病原菌的分离和致病性测定

对猫豆叶片、茎蔓和豆荚各5个病害标样进行病原分离，分离纯化得到形态特征一致的菌株21株。这些菌株经针刺法接种到离体的叶片、茎蔓和豆荚上，发病率可达100%。接种后第3天，叶片发病，第7天，茎蔓和豆荚发病，均在接种部位形成黑色近圆形病斑，症状比田间自然发病症状较重（图2）。田间刺伤法接种的植株发病较早，接种病原后第7天，叶片发病，第12天茎蔓和豆荚开始发病，发病率为100%。无伤口接种的植株发病时间晚7～10 d，发病率为70%。田间接种的症状和自然发病症状相同。对照植株不发病。从发病的病斑上能再分离到与接种菌株形态一致的病原菌。

图2 猫豆炭疽病离体接种症状Fig.2 Inoculation symptoms of velvet bean anthracnose

2.3 病原菌形态学鉴定

病原菌在PDA平板上，菌落圆形，边缘整齐，气生菌丝初为白色，后渐变为灰白色或深灰色，菌丝排列整齐，毛绒状。培养7 d后，靠近菌落中央产生轮纹状排列的分生孢子盘，并在其上产生红色分生孢子团。分生孢子盘圆形或椭圆形，黑褐色，直径（100～300）μm；刚毛少，暗褐色，横隔1～2个，（65～70）μm×（5～6）μm；分生孢子梗短，圆筒形，基部浅褐色，（12～20）μm×（4～5）μm；分生孢子单胞，无色，长椭圆形，两头钝圆或一端稍尖，大小（11.5～20.3）μm×（4.2～6.0）μm，平均为15.9μm×5.1μm（图3）。参照《真菌鉴定手册》［7］及《植物病原真菌学》［8］，将该病原菌鉴定为胶孢炭疽菌［Colletotrichumgloeosporioides（Penz.）］。

2.4 分子生物学鉴定

将病原菌的DNA通过PCR扩增后，对扩增产物进行测序，获得530 bp的DNA序列（图4）。该序列与GenBank中核酸数据进行Blast比较，与已报道的多个胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）及其有性态围小丛壳 菌 ［Glomerellacingulata（Stonem.）Spauld.et Schrenk］的序列相似性最高，相似性达99%～100%。

图3 猫豆炭疽病病原形态Fig.3 Pathogen morphology of velvet bean anthracnose

图4 猫豆炭疽病病原菌的ITS r DNA序列Fig.4 ITS r DNA sequence of the velvet bean anthracnose pathogen

3 结论与讨论

近年来，猫豆在广西大面积种植，已经成为部分农民脱贫致富的途径之一，然而，猫豆炭疽病的发生给猫豆产业的发展和农民的增收产生较大的影响，至今尚无关于该病的研究报道。为明确该病病原和有效控制病害的发生，本研究结合形态学特征和分子生物学特性，将该病原鉴定为胶孢炭疽菌。胶孢炭疽菌是世界上分布最广的植物病原菌之一，危害多种寄主植物，但该病原危害猫豆为国内首次报道。此外，胶孢炭疽菌在致病性、寄主特异性和遗传同质性等方面可分成许多亚组，属多形态种［9］，对所获得的菌株的寄主范围及专化型的确定尚待进一步的工作。由于胶孢炭疽菌引起的多种植物病害的侵染循环和发病条件相似，因此，可参考由该病原引起的其他作物炭疽病的防治方法进行控制，如选用无病种子或进行种子消毒、及时清除病残体、合理密植、创造良好的通风透光条件、合理施肥用水等，或在发病初期使用25%咪鲜胺乳油1 500倍液喷雾［10］。具体防治药剂及综合防治技术的建立尚待室内筛选试验和田间实践验证。

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［5］Suresh S，Prithiviraj E，Prakash S.Dose－and time－dependent effects of ethanolic extract ofMucuna pruriensLinn.seed on sexual behaviour of normal male rats［J］.Journal of Ethnopharmacology，2009，122（3）：497－501.

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