HPLC同时测定柴胡中黄酮和皂苷成分含量方法的改进

赵森铭

(洛阳市食品药品检验所，河南 洛阳 471023)

HPLC同时测定柴胡中黄酮和皂苷成分含量方法的改进

赵森铭*

(洛阳市食品药品检验所，河南 洛阳 471023)

目的：改进HPLC同时测定柴胡中黄酮和皂苷含量的方法。方法：采用MERCK PUROSPHER®STAR C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇-0.05%磷酸(梯度洗脱)；流速为1.0 mL·min-1；柱温为35 ℃；检测波长为210 nm。结果：2个黄酮成分(芦丁、槲皮素)和2个皂苷成分(柴胡皂苷a、柴胡皂苷d)分别在0.36～9.09 μg(r=0.999 7)、0.47～11.70 μg(r=0.999 5)、1.15～28.66 μg(r=0.999 8)和0.66～16.46 μg(r=0.999 8)线性关系良好；平均回收率为96.39%，97.44%，100.04%，97.89%，RSD均小于1.0%。结论：本方法简便准确、稳定可靠，可以用于同时测定柴胡中黄酮和皂苷成分的含量。

柴胡；黄酮；皂苷；高效液相色谱法

柴胡(Bupleuri Radix)药材来源于伞形科(Umbelliferae)植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狭叶柴胡BupleurumscorzonerifoliumWilld.的干燥根。上述两个来源的植物根作为药材按性状不同又分别习称为“北柴胡”和“南柴胡”[1]。柴胡作为药材始载于《神农本草经》，列为上品，名为地薰。至《本草纲目》李时珍又名为茈胡(茈音柴)，李时珍描述茈胡：生山中，嫩苗为山菜，老而采根，名为柴胡[2]。现代一般认为北柴胡入药佳，疗效好，被视为道地药材[3]。临床上柴胡最常用于治疗感冒发热。此外，柴胡也是治疗疟疾寒热的常用之品[4]。

随着近些年对柴胡药效物质基础的深入研究发现，不仅柴胡中皂苷类成分有生理活性，柴胡中黄酮和多糖成分也有重要的临床意义[5-6]。近年来研究者逐步关注柴胡中黄酮和多糖类成分的质量控制[7]。同时测定柴胡中皂苷和黄酮成分含量有现实意义，但仅有一篇研究文献[8]。此篇文献采用双波长法，分别在203 nm测定皂苷成分和360 nm测定黄酮成分，方法比较复杂。通过试验，建立了单波长(210 nm)的HPLC法。

1 仪器与试药

Waters2695高效液相色谱仪(2996紫外检测器)，MSA225S十万分之一电子分析天平(德国赛多利斯)，AX200型万分之一电子分析天平(日本岛津公司)，KQ2200B超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，HH-6恒温水浴锅(江苏金坛市宏华仪器厂)。

芦丁对照品(批号：0080-9504)；槲皮素对照品(批号：100080-200707)；柴胡皂苷a对照品(批号：110777-200507)；柴胡皂苷d对照品(批号：110777-200507)；上述对照品均购自中国食品药品检定研究院。甲醇为进口色谱纯，娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

柴胡样品1(洛阳同华堂大药房，批号：120709)；样品2(洛阳百家好一生大药房，批号：120102)；样品3(洛阳开心人大药房，批号：120305)；样品4(洛阳市食品药品检验所标本1)；样品5(洛阳市食品药品检验所标本2)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

MERCK PUROSPHER®STAR C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-0.05%磷酸为流动相，线性梯度洗脱0～8 min(57∶43)、8～25 min(76∶34)、25～30 min(57∶43)；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为210 nm。理论板数按芦丁峰计算应不低于3 000。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取芦丁对照品9.09 mg，槲皮素对照品12.92 mg，柴胡皂苷a 28.66 mg，柴胡皂苷d对照品16.46 mg，分别置于50 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别制成每1 mL含芦丁0.181 8 mg、槲皮素0.233 9 mg的混合对照品溶液和柴胡皂苷a 0.573 2 mg、柴胡皂苷d 0.329 2 mg的混合对照品溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取柴胡50 g，粉碎，过四号筛，精密称取1 g置具塞150 mL锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，30 ℃水温超声处理(功率200 W，频率40 kHz)30 min，放至室温，称定重量，补足减失重量，滤过，用甲醇20 mL分2次洗涤容器及药渣，洗液与滤液合并，回收溶剂至干。残渣加适量甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得样品溶液。用溶剂作为空白。精密吸取上述溶液各10 μL注入高效液相色谱仪，按2.1方法测定，记录色谱图。结果芦丁、槲皮素、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d与相邻成分达到基线分离。见图1。

1.芦丁 2.槲皮素 3.柴胡皂苷a 4.柴胡皂苷dA.芦丁和槲皮素对照品 B.柴胡皂苷a和柴胡皂苷d对照品 C.溶剂空白 D.柴胡样品图1 柴胡样品及对照品HPLC图

2.4 线性关系考察

分别精密吸取2.2项下混合对照品溶液(芦丁0.181 8 mg·mL-1、槲皮素0.233 9 mg·mL-1柴胡皂苷a 0.573 2 mg·mL-1、柴胡皂苷d 0.329 2 mg·mL-1)2，5，10，20，30，50 μL，按2.1色谱条件进行HPLC分析，记录色谱图，以各指标成分进样量(μg)为横坐标，以其相对应的峰面积(Y)为纵坐标，进行回归处理，结果芦丁回归方程为：Y=270 795X-21 771，r=0.999 7，表明芦丁在0.36～9.09 μg线性关系良好；槲皮素回归方为：Y=97 421X+ 203.91，r=0.999 5，表明槲皮素在0.47～11.70 μg线性关系良好；柴胡皂苷a回归方程为：Y=351 268X-144 127，r=0.999 8，表明柴胡皂苷a在1.15～28.66 μg线性关系良好；柴胡皂苷d回归方程为：Y=3 230 764X+70 198，r=0.999 8，表明柴胡皂苷d在0.66～16.46 μg线性关系良好。

2.5 精密度试验

分别精密吸取2.2项下混合对照品溶液10 μL，在2.1色谱条件下各重复进样5次，记录峰面积，计算芦丁、槲皮素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的RSD为0.94%，1.01%，0.33%，0.86%，说明方法精密度良好。

2.6 稳定性试验

分别精密吸取2.2项下混合对照品溶液10 μL，在2.1色谱条件下，在1，4，6，8，10，12 h各测定1次，记录峰面积，分别计算芦丁、槲皮素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的峰面积的RSD为1.29%，1.46%，1.45%，1.80%，说明供试品中溶液在12 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取样品1(批号：120709)50 g，粉碎，过四号筛，精密称取5份样品(1.011 8，1.017 8，1.011 5，1.012 1，1.016 6 g)，按照2.3项下操作制备供试品溶液，在2.1色谱条件下测定含量，记录峰面积，计算芦丁、槲皮素、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的平均含量分别为1.453 7，1.712 7，5.131 4，16.614 1 mg·g-1，RSD分别为1.37%，1.25%，1.12%，1.16%，说明方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取样品1(批号：120709)50 g，粉碎，过四号筛，精密称取5份样，精密加入芦丁、槲皮素混合对照品溶液5 mL，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d混合对照品溶液10 mL，按照2.3项下操作制备供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液各10 μL，在2.1色谱条件下进行样品含量测定，记录峰面积，分别计算样品中指标成分的回收率和RSD。结果见表1。

2.9 样品的测定

取样品1～5各50 g，粉碎，过四号筛，每个样品精密称取5份，按2.3项下操作制备供试品溶液，在2.1色谱条件下测定含量，记录峰面积，分别计算样品1～5中指标成分的平均含量和RSD。结果见表2。

表1 回收率试验结果

表2 柴胡样品含量测定(n=5)

3 讨论

3.1 检测波长的选择

对芦丁、槲皮素、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d对照品溶液分别进行200～400 nm扫描，采用对照品溶液稀释至吸光度在0.5左右进行测定，结果芦丁在366，266，208 nm处有最大吸收，槲皮素在297，205 nm处有最大吸收，柴胡皂苷a在209 nm处有最大吸收，柴胡皂苷d在205 nm处有最大吸收。测定4种指标成分混合对照品溶液和样品溶液，结果混合对照品溶液在290，208 nm处有最大吸收，样品溶液在338，294，270，212 nm处有最大吸收，综合上述情况，最终选择210 nm为检测波长。

3.2 流动相的选择

流动相的选择主要在甲醇-磷酸水系统和乙腈-磷酸水系统之间进行。综合文献发现甲醇-磷酸水系统是黄酮成分较常用的系统。但是在具体实验过程中发现，乙腈-磷酸水系统在微调流动相比例过程中不如甲醇-磷酸水系统灵敏，结果选择了甲醇-磷酸水系统。通过试验调整流动相梯度洗脱比例，使各主成分与相邻成分分离度达到1.5。结果确定流动相梯度洗脱比例为0～8 min(57∶43)、8～25 min(76∶34)、25～30 min(57∶43)。

3.3 提取溶剂和方法的选择

在文献[1]方法的基础上，比较5%氨溶液-甲醇提取与甲醇提取，结果选择甲醇提取。

3.4 样品的测定

通过对3批市售柴胡和2批标本中芦丁、槲皮素、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 4种指标成分含量测定，表明建立的方法简便、可靠，可以同时测定柴胡中皂苷和黄酮成分的含量，该研究为深化控制柴胡质量奠定了良好的基础。

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ImprovementofFlavonoidsandSaponinsDeterminationinRadixBupleuribyHPLCMethod

ZHAO Sen-ming*

(LuoyangInstituteforFoodandDrugControl，Luoyang471003，China)

Objective：To detect flavonoids and saponins content in Bupleuri Radix by improved HPLC method.Methods：Using MERCK PUROSPHER®STAR C18column (250 mm×4.6 mm，5 μm)；the mobile phase was methanol-0.05% phosphate (gradient elution)；flow rate was 1 mL·min-1；column temperature was 35 ℃；the detection wavelength was 210nm.Results：2 flavonoids (rutin，quercetin) and 2 saponins (saikosaponin a，saikosaponin d)in 0.36-9.09 μg(r=0.999 7)，0.47-11.70 μg (r=0.999 5)，1.15-28.66 μg(r=0.999 8)and 0.66-16.46 μg(r=0.999 8)linear ranges；the average recovery rate was 96.39%，97.44%，100.04% and 97.89% respectively，all RSD<1.0%.Conclusion：This method is simple，accurate，stable and reliable，Can be used for the simultaneous determination of flavonoids and saponins in Radix Bupleuri.

Bupleurum Radix；Flavonoids；Extraction；HPLC

2013-04-01)

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赵森铭，研究方向：药品质量控制，E-mail：71971014@qq.com