当归多糖对老年痴呆小鼠脑组织钙超载及胆碱能神经损伤的影响*

李雪燕，安方玉，李世功，陈开兵，张丽云

(1.甘肃中医学院，甘肃 兰州730000;2.甘肃省武威肿瘤医院，甘肃 武威733000;3.甘肃中医学院附属医院，甘肃兰州730020)

痴呆综合征是中老年常见病，目前尚无理想治疗方案，因而早期发现、及时防治成为医学界的研究焦点。由于西药疗效不尽人意，而且多数价格较昂贵，所以从单味中药提取有效成分用于及早防治成为该领域研究的重要组成部分。大量研究证实:中药多糖确有明显的延缓衰老的作用［1－4］。当归多糖是甘肃道地药材当归的有效成分之一，已有文献［5］报道:当归多糖具有抗肿瘤、延缓衰老、治疗老年痴呆等作用，但是其延缓衰老和治疗老年痴呆的确切机制尚未明确，因此本研究观察老年痴呆小鼠小鼠脑组织 Ca2+浓度、Ca2+-ATPase、Ca2+Mg2+-ATPase和AchE活性的变化，以期揭示当归多糖抗衰老和治疗老年痴呆的作用机制。

1 材料与仪器

1.1 动 物

清洁级昆明种小鼠72只，雌雄各半，体质量(20±2)g，由甘肃中医学院科研动物中心提供，实验动物合格证号:SCXK(甘)2011－0001－0001126。

1.2 药品、试剂与仪器

当归多糖，陕西慈缘生物技术有限公司产品，批号CY110320，用生理盐水配制成10 g/L的储备液以备用。D－半乳糖，北京化学试剂公司产品，批号020123，临用前用生理盐水配制成12 g/L液体备用;亚硝酸钠，西安化学试剂厂产品，批号860723，临用前用生理盐水配制成9 g/L液体备用。钙测定试剂盒(批号20111023)、Ca2+-ATPase试剂盒(批号20110817)、Ca2+Mg2+-ATPase 试 剂 盒 (批 号20110810)、AchE试剂盒(批号20110720)及考马斯亮蓝测定试剂盒(批号20110716)，均由南京建成生物工程研究所提供。SK3300H型数控超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司产品;VIS-723N型紫外可见分光光度计，北京瑞利分析仪器有限公司产品;BS224S型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司产品;HH-4数显恒温水浴锅，郑州杜甫仪器厂产品;XYJ80-20型离心机，金坛市恒丰仪器厂产品;XW-80A型旋涡混匀器，上海精科实业有限公司产品;ZY12306型微量加样器，Scientific产品。

1.3 动物分组、给药与模型的建立

将小鼠按照随机数字表法分为空白对照组、模型对照组、脑复康组及当归多糖低、中、高剂量组共6组，每组12只。除空白对照组外，其余各组每日腹腔注射 D －半乳糖120 μg/g 和亚硝酸钠90 μg/g［6－7］，联合给药制备老年痴呆小鼠模型;空白对照组腹腔注射等体积的生理盐水，连续30 d。30 d后，腹腔注射同时，脑复康组灌胃给脑复康200 μg/g，当归多糖高、中、低剂量组则依次灌胃给当归多糖400，200和100 μg/g;模型对照组及空白对照组灌服等体积的生理盐水，连续6周。断头处死小鼠，取大脑用冷生理盐水冲洗，剥取大脑组织，用生理盐水制成100 g/L脑匀浆，3000 rpm/min低温离心10 min，取上清液备用。

1.4 检测指标

定磷法分别比色测定 Ca2+浓度及Ca2+-ATPase、Ca2+Mg2+-ATPase活性;对称三硝基苯(TNB)比色测定AchE活性;考马斯亮蓝检测蛋白定量。检测步骤严格遵照试剂盒说明书。

1.5 统计学方法

采用SPSS 14.0统计分析软件处理。所有数据以均数()±标准差(s)表示，组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠脑组织 Ca2+浓度、Ca2+-ATPase及Ca2+Mg2+-ATPase活性对比

与空白对照组对比，模型对照组小鼠脑组织Ca2+浓度升高，Ca2+-ATPase及 Ca2+Mg2+-ATPase活性下降，差别有统计学意义(P＜0.01)。与模型对照组对比，当归多糖各剂量组脑组织Ca2+浓度降低，Ca2+-ATPase及Ca2+Mg2+-ATPase活性增高，尤其中、高剂量组Ca2+Mg2+-ATPase活性提高更为明显，差别有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);与脑复康组对比，高剂量组较之差别有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 各组小鼠脑组织Ca2+浓度、Ca2+-ATPase及Ca2+Mg2+-ATPase活性对比n=12，±s

表1 各组小鼠脑组织Ca2+浓度、Ca2+-ATPase及Ca2+Mg2+-ATPase活性对比n=12，±s

注:与空白对照组对比，*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01;与模型对照组对比，#P ＜0.05，##P ＜0.01;与脑复康组对比，△ P ＜0.05。

组 别 剂量/(μg·g－1) Ca2+/(mmol·gprot－1) Ca2+-ATPase/(U·mgprot－1) Ca2+Mg2+-ATPase/(U·mgprot－1)2.27 ±0.97 3.23 ±1.08 25.94 ±8.34模型对照组 0 4.58±1.09＊＊ 1.66±1.09＊＊ 13.95±2.82＊＊脑复康组 200 2.87 ±1.09* 2.96 ±1.16# 20.83 ±6.19#当归多糖低剂量组 100 3.03 ±1.20* 2.83 ±1.03# 19.46 ±4.87#当归多糖中剂量组 200 2.19±1.27＊＊ 3.35±1.90## 25.88±7.92##当归多糖高剂量组 400 1.63±1.02##△ 4.23±1.99##△ 29.32±7.56##△空白对照组0

2.2 各组小鼠脑组织AchE活性对比

与空白对照组对比，模型对照组小鼠脑组织AchE活性升高(P＜0.01)。与模型对照组对比，当归多糖各剂量组AchE活性降低(P＜0.05或P＜0.01);与脑复康组对比，仅高剂量组较之差别有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 各组小鼠脑组织AchE活性对比n=12，±s

表2 各组小鼠脑组织AchE活性对比n=12，±s

注:与空白对照组对比，*P＜0.05，＊＊ P＜0.01;与模型对照组对比，#P ＜0.05，##P ＜0.01;与脑复康组对比，△ P ＜0.05。

组 别 剂量/(μg·g－1) AchE/(U·mL－1)25.45 ±7.82模型对照组 0 45.53 ±5.99＊＊脑复康组 200 35.71 ±3.45#当归多糖低剂量组 100 35.90 ±13.69#当归多糖中剂量组 200 29.31 ±21.76##当归多糖高剂量组 400 24.77 ±10.34##△空白对照组0

3 讨论

老年性痴呆是一种以进行性认知障碍和记忆能力损害为主的中枢神经系统退变性疾病。目前有关痴呆的学说很多，如钙稳态失调、胆碱能神经损害、自由基损伤、基因突变、能量代谢障碍、神经细胞凋亡、淀粉样蛋白(Aβ)沉积等［8］。钙稳态失衡学说认为:钙在神经元的发育、突触间传递、神经可塑性、各种代谢通道的调节中承担着信号转导的重任。但是随着细胞老化，细胞内能量代谢水平下降，维持细胞膜电位所必需的三磷酸腺苷依赖性膜运输减少，使离子通道受损，进而引起一系列的可能在老年痴呆发病中起作用的变化Ca2+的跨膜转运受到影响，Ca2+缓慢持续内流，细胞内 Ca2+水平增高，产生细胞内钙过负荷。胆碱能神经损伤学说则认为:老年痴呆者海马及额叶的胆碱能神经元易受损害使乙酰胆碱产生缺陷。胆碱能神经元发生损害后，可能会引起突触减少甚至丧失，引起认知、记忆等多方面的功能障碍。脑内胆碱能神经系统的退变被认为是造成AD的最重要病理因素之一［9］。在阿尔茨海默病患者脑中，基底前脑的胆碱神经细胞明显丢失，胆碱能神经纤维退变，患者脑脊液和脑组织中胆碱乙酰转移酶、AchE在脑内的表达出现异常，乙酰胆碱的合成、释放、摄取等功能亦下降。针对上述两种学说，已有研究［10］证实:当归可提高D－半乳糖所致老年痴呆模型小鼠脑细胞膜的Ca2+-ATPase的活性，提示当归通过增加Ca2+-ATPase活性而降低细胞钙的含量;中药多糖对老年痴呆模型小鼠胆碱能神经损伤具有修复作用。

本实验结果显示:与空白对照组对比，D－半乳糖和亚硝酸盐致老年痴呆小鼠模型的脑组织Ca2+含量和AchE活性升高、Ca2+-ATPase及Ca2+Mg2+-ATPase活性降低，差别有统计学意义(P＜0.01);与模型对照组对比，当归多糖高剂量组脑组织Ca2+含量及 AchE活性降低，脑组织 Ca2+-ATPase、Ca2+Mg2+-ATPase活性提高，差别有统计学意义(P＜0.05)。提示:当归多糖抗老年痴呆的机理可能是通过改善脑细胞膜对Ca2+-ATPase及Ca2+Mg2+-ATPase的敏感性，恢复脑细胞膜正常的离子转运，使脑细胞代谢趋于正常;或者是通过改善中枢胆碱能神经系统的功能实现的。其相关基因和蛋白表达及信号转导机制有待进一步深入研究。

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