基于TaqMan探针的幽门螺杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

石建玲，程 波，刘 珊，吴西钊，权兰菊，丁姗姗，孙锁柱

（中国人民解放军第二炮兵总医院，北京100088）

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，HP）自1983年被澳大利亚学者沃伦（Warren）与马歇尔（Marshal1）［1］发现以来，国内外对它的分子生物学、致病机制、流行病学、相关疾病等方面进行了大量的研究［2－5］，现代医学也已经证明，HP可以导致慢性胃炎、十二指肠肠炎、消化性溃疡、胃癌、粘膜相关性淋巴瘤（MALT）等疾病的发生。WHO将HP作为胃癌的主要致病因子。因此，快速、准确的检测HP的感染对大众健康具有重要意义，对医生治病也有巨大帮助。

实时荧光定量PCR技术具有高灵敏度和高特异性的优点，目前，国内已应用该技术检测了百日咳鲍特菌［6］和沙眼衣原体［7］等多种微生物的感染。我们以HP高度保守的23SrDNA基因片段序列设计引物和探针，建立实时荧光定量PCR方法来检测HP。

1 材料与方法

1.1 样品

选取市售的HP菌株26695，对照菌株有Brevibacterium casei，Klebsiella pneumonia，Staphylococcus capitis，Microbulbifer elongates，Microbacterium sp，Streptococcus cristatus，Pichia anomala，EHEC，EIEC，Salmonella typhi，Dysentery bacterium，Vibrio Cholerae。

1.2 试剂与仪器

Taq DNA聚合酶、dNTPs、pEASY－T载体、DNA提取的试剂盒（Omega E.Z.N.A.MicroElute Genomic DNA Kit）、大肠杆菌DH5a、幽门螺杆菌抗体、DAB显色液、W－S银染试剂、SMA4000核酸蛋白分析仪、ABI7500P实时荧光定量PCR扩增仪等。

1.3 引物和探针的设计

选取高度保守的HP特异性的23SrDNA基因序列，利用Primer Express 3.0软件进行引物和探针的设计。引物和探针序列如下：

P1：gattcagtgaaattgtagtggagg

P2：tcccattagcagtgctaagttg

探针：5′－gcggcaagacggaaagaccccgtgg－3′

引物及探针由英俊公司合成，扩增目的片段长度为99bp，其他实时荧光定量PCR反应体系组分（ExTaq酶等）购自takar公司。

1.4 模板DNA的制备

按照购买的DNA提取试剂盒标明的方法进行基因组DNA的提取。

1.5 制备质粒

反应体系为20μl，以P1、P2为引物，反应条件为：95℃5min；95℃10s，60℃45s，40个循环。扩增得到的目的片段克隆至pEASY－T载体，转化感受态细胞DH5α，提取质粒，测序验证后作为荧光定量PCR的质粒标准品，梯度稀释成1.0×107～1.0×101拷贝每微升作为阳性标准品。

1.6 实时荧光定量PCR反应条件的优化

以阳性质粒标准品为模板，在不同退火温度下进行常规PCR反应，电泳分析扩增产物，确定最佳退火温度。20μl体系Taqman荧光定量PCR反应程序为95℃ 5min；95℃ 10s，60℃ 45s，40个循环；应用矩阵法对荧光定量PCR的引物、探针浓度进行优化，以达到最佳反应条件。

1.7 标准品的扩增曲线及标准曲线的建立

以每微升拷贝数为107、106、105、104、103、102、101的质粒标准品为模板，最佳反应条件下在ABI－7500荧光定量PCR仪上检测，得出各自的动力学曲线，仪器自动生成标准曲线。

1.8 敏感性试验

取不同拷贝数的标准品，进行实时荧光定量PCR检测。根据样品拷贝数与CT值之间的线性关系和相关系数确定最小检测量。

1.9 特异性试验

对选取的对照菌株进行DNA提取，按照建立的实时荧光定量PCR方法进行测定，建立特异性试验。

1.10 可重复性试验

将105、104、103、102不同拷贝数的标准品重复测定3次，并进行统计学分析，根据变异系数确定检测体系的可重复性。

1.11 临床胃镜标本检测

对2012年5月至10月收集的100份胃镜样本进行检测同时用免疫组化方法和银染进行比较分析。

2 结果

2.1 标准品的扩增曲线及标准曲线的建立

每微升拷贝数为107、106、105、104、103、102、101的质粒标准品为模板进行实时荧光定量PCR检测，得到标准品的扩增曲线（图1），同时仪器自动生成标准曲线（图2），线性关系为Y＝－3.605X＋42.853。标准品的扩增曲线显示107－102有明显的S型扩增曲线，而且指数增长期的曲线平行，说明PCR的扩增效率相近；不同稀释度标准品之间的Ct值相差均匀，这与定量PCR的Ct值与起始拷贝数之间有严格的线性关系相一致。

图1 幽门螺杆菌Taqman探针实时荧光定量PCR质粒标准品扩增曲线

图2 幽门螺杆菌Taqman探针实时荧光定量PCR质粒标准品标准曲线

对标准曲线进行分析，R2值为1。因此，标准曲线在107至102拷贝每微升范围内存在良好的线性关系。

2.2 检测方法的敏感性

将以上拷贝数的质粒标准品为模板进行实时荧光定量PCR检测，结果表明，该方法至少可以检测出每微升102拷贝数的HP样品。

2.3 检测方法的特异性

用建立的实时荧光定量PCR的方法对HP和对照菌株进行检测，只有HP为阳性，其余均为阴性，表明该方法具有良好的特异性。

2.4 重复性试验

重复性分析不同拷贝数的标准品批内重复测定3次，其变异系数在1%－2%范围之间，均在可接受的范围内，说明本实验建立的荧光定量PCR方法检测幽门螺杆菌具有良好的稳定性。

2.5 临床胃镜标本检测

实时荧光定量PCR以Ct值≤35并且扩增曲线呈 “S”形为阳性的判定原则。对100份样本进行检测，实时荧光定量PCR能检出31份阳性，而免疫组化方法能检出25份阳性，银染方法能检出28份阳性（图3、图4）。

图3 免疫组化法染色阳性结果（10×40）

图4 银染法染色阳性结果（10×40）

3 讨论

众所周知，实时荧光定量PCR技术是一种直接检测核酸的分子生物学技术，该方法灵敏度高、特异性好、操作简单，它已广泛应用于多种微生物感染的检测［6，7］，国 内 外 亦 有 用 该 方 法 检 测 HP 的 报道［8，9］。江南［10］和李广云［11］的荧 光定量 PCR 检测选用的是HP的16SRNA基因，而我们选用的是HP的23SrDNA基因，DNA比RNA稳定，不易降解，提取DNA比提取RNA的技术要求要低，操作简单；同时江南采用的是SYBR GreenⅠ，而我们采用的是Taqman探针的方法，Taqman探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在5′末端，淬灭基团连接在3′末端，一分子的产物生成伴随着一分子的荧光信号的产生，因此Taqman探针检测的是积累荧光，由于增加了探针的识别步骤，它的特异性更高。而SYBR GreenⅠ属于非探针类，是一种能与双链DNA结合发光的荧光染料，由于它不能识别特定的双链，因此它的特异性较差，对PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，所以会有假阳性的发生。

用该方法与免疫组化、银染共同检测100例临床胃镜标本，结果显示，实时荧光定量PCR方法具有较高的敏感性，可以大大降低漏检率。免疫组织化学和银染是将所取的胃黏膜标本切片染色镜检，通过实践发现。免疫组织化学和银染容易发生染液的杂质干扰，产生假阳性，它的敏感性和特异性都依赖于观察者的经验和技术。

本研究结果显示，所建立的实时荧光定量PCR方法具有以下特点：（1）检测范围宽，在107－102copies/ul范围内均呈现良好的线性关系，相关系数为1；（2）灵敏度高，可检测102copies/ul的样本；（3）特异性高，与多种细菌均无交叉反应。（4）检测速度快，整个PCR反应过程仅需70min。（5）重复性好，不同拷贝数的标准品批内重复测定3次，其变异系数在1%－2%范围之间范围。

实时荧光定量PCR检测方法是近年来应用较为广泛的一种检测方法，具有快速准确等优点。本文从引物和探针的设计、PCR程序的设计等方面建立了HP检测的一种方法，是对目前临床HP检测方法的一种补充与完善，具有重要的临床意义。

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