鸡传染性支气管炎病毒变异株ZZ2004 RT－PCR检测方法的建立及应用

姚四新，王宪文，赵淑秋，刘兴友

（1．河南科技学院动物科学学院，河南 新乡453003；

2．动物疫病和残留物防控河南省高校工程技术研究中心，河南 新乡453003）

鸡传染性支气管炎病毒（IBV）属于冠状病毒科（Coronavirdae）冠状病毒属（Coronavirus）的病毒。该病毒的特点是S1基因极易变异，导致新的血清型不断出现。临床上常见的有呼吸型、肾型、肠炎型及腺胃型传染性支气管炎［1－4］。2004年3月我们从河南郑州地区具有腹泻、呼吸道症状及肾脏病变的肉鸡及无明显症状仅生长缓慢的肉鸭体内分离到1株能引起鸡胚蜷缩、出血的传染性支气管炎病毒，该毒株和其他血清型IBV毒株之间没有交叉的血清学关系，证实为一种新的变异株，命名为ZZ2004。感染后鸡群主要特征是：病鸡气管啰音、咳嗽和打喷嚏，主要侵害鸡的呼吸、泌尿生殖、免疫系统和消化系统等。该病发病率很高，可导致感染的肉鸡群免疫功能及增重和饲料报酬显著降低，可致幼鸡死亡，同时还可影响肉鸭的生长发育，严重者导致死亡。但只凭这些临床症状及剖检病变往往不能准确判断病因．必须依靠实验室检验［5－6］。随着现代分子生物学技术的发展，国内许多学者已经将RT－PCR技术应用于IBV的检测［7－9］。

IBV为不分节段的单股正链RNA病毒，其中mRNA3含有3个ORF，分别为3a，3b和3c，分别编码3种小蛋白即3a、3b、E（envelop E），其大小分别为6．7kD、7．4kD和12．4kD，其中3cORF的启动子效率最高 ，12．4kD产物的表达量最大 ，其疏水氨基酸的组成特点揭示了该蛋白与病毒囊膜的嵌合 ，这可能与病毒的复制有关。笔者将ZZ2004 3a、3b及E基因作为RT－PCR诊断的基因，根据其保守序列，设计并合成了一对引物，建立了检测IBV ZZ2004变异株的RT－PCR方法。

1 材料与方法

1．1 菌株、载体及试剂 RNA提取试剂盒、Ecoli JM109、pMD18－T、RT－PC试剂盒、凝胶 DNA快速纯化回收试剂盒，购自宝生物工程（大连）有限公司；Trizol，购自Invitrogen公司。

1．2 病毒 鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）ZZ2004由本实验室分离并保存。IBV M41、H120、H52毒株以及新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）、传染性囊病病毒（IBDV），由中国兽医药品监察所提供。

1．3 引物设计 根据GenBank中鸡传染性支气管炎病毒ZZ2004株的3a、3b和3c部分序列，用Oligo 6软件设计了1对引物，具体引物序列如下：

上游引物：5′－TTAGAGAGTGCGTTGTAGCA－3′，下游引物：5′－AGCTCCTGGAACTACTACCC－3′，两引物之间的跨幅为540bp，由北京赛百盛基因技术有限公司合成。

1．4 病毒RNA的提取 用DNA／RNA提取试剂盒（MiniBEST Viral RNA／DNA Extraction Kit Ver．3．0）提取RNA，参照试剂盒说明书进行。

1．5 cDNA合成及PCR扩增 反转录程序为30℃10min，42℃30min，95℃5min，4℃保存。

PCR反应程序：94℃，5min；94℃1min，55℃2 min，72℃2min，共35个循环，最后于72℃延伸10 min。反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定

1．6 特异性测定 应用所建立的PCR方法扩增IBV ZZ2004以及 NDV、IBV（G 毒株）、IBV（HN 毒株）、IBDV检测该方法的特异性。回收IBV RT－PCR电泳条带，与pMD18－T载体相连，转化感受态Ecoli JM109，铺氨苄抗性LB琼脂平板（Amp＋）37℃倒置培养，经鉴定后挑取阳性菌落进行扩大培养，送TaKaRa公司测序。

1．7 敏感性测定 将按1．4方法制备的IBV cDNA，然后进行10倍比稀释，取5μL做模板，其他条件不变进行PCR检测扩增。以出现阳性反应条带模板用量的最高稀释倍数，计算可检出最低IBV－cDNA量。

1．8 疑似分离毒株的检测 应用建立的RT－PCR方法对从河南省分离的10株疑似鸡IBV ZZ2004进行检测。

2 结果

2．1 IBV M基因的RT－PCR特异性检测结果

2．1．1 IBV－cDNA 含量测定 从IBV ZZ2004鸡胚尿囊液中反转录出的IBV－cDNA，经Eppendorf Biophotometer蛋白核酸测定仪测定IBV－cDNA终浓度为30．5μg／mL。

2．1．2 IBV 3a、3b基因和3c基因的RT－PCR检测结果 采用1．3设计的引物从IBV ZZ2004鸡胚尿囊液中扩增出长度为540bp的片段（图1）

图1 ZZ2004病毒基因的RT－PCR鉴定

2．1．3 RT－PCR检测 IBV的特异性结果 应用所建立的RT－PCR方法扩增IBV ZZ2004以及NDV、IBV（G 毒 株）、IBV（HN 毒 株）、IBDV，仅 IBV ZZ2004出现特异性目的条带，其他均未扩出任何条带，证明该方法具有良好的特异性（图2）。

图2 ZZ2004病毒基因的特异性RT－PCR试验结果

2．2 RT－PCR检测IBVZZ2004的敏感性 将已知含量的IBV－cDNA，进行10倍比稀释分别进行扩增，结果显示，本方法可检出1．525ng的IBV－cDNA（图3）。

图3 ZZ2004病毒基因的敏感性PCR试验结果

2．3 疑似分离毒株的检测方法 应用建立的RTPCR方法对从河南省分离的10株疑似鸡IBV ZZ2004进行检测，结果9株为阳性，结果见图4。

3 讨论

本试验建立的RT－PCR技术对IBV ZZ2004检测有极强的特异性，应用RT－PCR方法检测鸡IBV国内外均有报道［9－11］，但大都以 M 基因和N基因为目的基因，于申业等（2007）［12］选取变异频率很大的免疫原S1基因，所建立的RT－PCR检测方法可以特异性的检测鉴定出具体的血清型或基因型。此外，IBV基因组较大，在提取、反转录等过程中很容易断裂，用跨度大的引物进行扩增难度较大。针对上述特点，本试验通过比较已发表的各血清型的3a、3b基因及E基因序列，选取跨越IBV 540bp片段的引物，既降低了扩增的难度，使得试验容易操作，又保证了反应的特异性。用同样的PCR 扩增技术对 M41、H120、H52、NDV、IBDV、AIV进行检测，结果均为阴性，其他血清型的标准毒株也未出现扩增条带，只有IBV ZZ2004呈阳性，表明本试验所建立的方法特异性强，可以准确地将IBV ZZ2004与其他IBV血清型区别开来，这对鉴别诊断IBV ZZ2004变异株有重要意义。敏感性试验结果表明，该方法可检出最低限量为1．525pg的模板，而且经多次试验结果相同，证明建立的检测方法具有较高的敏感性。虽然本试验所建立的RT－PCR检测法具有快速、敏感、特异等特点，但此方法能否区分IBV疫苗毒和感染毒尚有待于进一步验证。

总之，迄今为止国内外有关应用RT－PCR技术检测IBV的方法很多，但以3a、3b基因及E基因序列为目的基因者鲜有报道，本试验针对感染鸡同时又感染鸭的IBV ZZ2004进行特异性诊断与检测，有望为IBV致病机制的深入研究打下基础。

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