赛拉嗪麻醉对大鼠大脑皮质神经细胞游离钙离子浓度的影响

李志强，李小波，石星星，尹柏双，范宏刚，王洪斌

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨150030）

钙离子（Ca2＋）是维持肌体细胞正常生理功能非常重要的离子，肌细胞、神经细胞等细胞功能的维持都依赖于Ca2＋。大量的试验已经证实Ca2＋是一种普遍存在的第二信使，在细胞内传递信息并调控一系列生命过程，比如基因转录、蛋白质的合成与分解、细胞的生长与凋亡等［1－3］。胞内第二信使通过磷酸化或直接作用参与调节许多酶和离子通道的活性，通过突触后机制广泛参与神经元之间的信息传递。全麻药影响神经元跨膜钙信息的传递，增加或抑制神经元胞内Ca2＋浓度，从而不同程度的影响神经细胞的活动［4］。因此，Ca2＋可能是全麻药的作用靶位之一。

赛拉嗪，又名二甲苯胺噻嗪，是一种α2－肾上腺素能受体激动药，是国内外常用的兽用麻醉药，具有中枢性镇静、镇痛和肌松作用。赛拉嗪的全麻机制在国内已有报道，但是未见赛拉嗪对大脑皮质神经细胞钙动力学影响的研究。本试验通过观察赛拉嗪麻醉对大鼠大脑皮质细胞内游离钙离子浓度的影响，来进一步探讨赛拉嗪的全麻分子机理。

1 材料与方法

1．1 试验材料 SD大鼠15只，雌雄兼备，体重160±20g，黑龙江省中医药大学实验动物中心提供；流式细胞仪（德国PARTEC公司）；恒温震荡培养箱（上海凯朗仪器设备公司）；Olympus倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）；血细胞计数板、计数器、手术器械等；赛拉嗪（东北农业大学高利教授惠赠）；Fluo－3／AM（北京博蕾德生物科技有限公司）；DMEM培养基、胰蛋白酶（北京格源天润生物技术有限公司）；HEPES（碧云天生物技术研究所）。

1．2 试验方法

1．2．1 大脑皮质神经细胞悬液制备及神经细胞存活率检测 参照Dildy等方法［5］，略有改进。取SD大鼠，用生理盐水冲洗和75%酒精灭菌后，断头置于冰上，小心快速地剥离脑膜，分离双侧大脑皮层组织立即置于冷pH值7．4Hank′s液中，洗2次后剪碎，置于0．125%胰酶液中，37℃轻轻搅拌20min，加入冷DMEM培养基（含10%小牛血清）中止消化。200目铁丝网过筛，3 000r／min离心5min，再以Hank′s液洗1次，最后用DMEM培养基制备成2×105个·mL－1细胞悬液。台盼蓝排斥试验检查神经细胞存活率：取适量一滴约90μL细胞悬液，加入10μL 0．2%台盼蓝染液，载玻片压片后计数，着色细胞为死亡细胞，计数存活细胞，每个样品计数3次，根据3次试验结果计算平均值。

1．2．2 流式细胞仪检测神经细胞内钙离子荧光强度

1．2．2．1 Fluo－3／AM 负载 将制备的神经细胞悬液于37℃恒温摇床振荡培养20min，1 500r／min离心5min，弃上清液。加入5倍体积的0．2%BSA－Hank′s液冲洗2次，用含有10%胎牛血清的DMEM培养基，再继续培养40min。用HEPES缓冲液洗涤细胞3次，然后用HEPES缓冲液使细胞重悬浮，制成细胞数量1×105个·mL－1的溶液备用。量取一定量的神经细胞悬液（含有105个细胞），1 500r／min离心5min，沉淀细胞，加入1mL的5μmol／L的Fluo－3／AM工作液轻轻摇匀使细胞在工作液中均匀分散，保持工作液中被检测的细胞数量在105个· mL－1。

1．2．2．2 试验分组及检测神经细胞内钙离子的荧光强度 将Fluo－3／AM负载细胞悬液分为对照组、KCl组、赛拉嗪低浓度组、赛拉嗪高浓度组：对照组不做处理；KCl组、赛拉嗪低浓度组、赛拉嗪高浓度组分别加入适量KCl溶液至终KCl浓度50mmol／L。同时赛拉嗪低、高浓度组分别加入适量的6 mmol／L赛拉嗪至终浓度分别为15μmol／L和60 μmol／L。

37℃下培养10min，然后选择发射波长为526nm，激发波长为488nm条件下用流式细胞仪检测神经细胞内钙离子的荧光强度，每组试验同一条件下重复6次，记录试验结果。

2 试验结果

台盼蓝排斥试验检查，细胞存活率在95% 以上。试验结果以细胞内钙离子荧光强度值变化表示钙离子动力学情况，钙离子浓度高低与荧光强度呈正相关。具体结果见表1。

表1 赛拉嗪麻醉对大鼠大脑皮质神经细胞游离钙离子荧光强度的影响 （±S，n＝6）

表1 赛拉嗪麻醉对大鼠大脑皮质神经细胞游离钙离子荧光强度的影响 （±S，n＝6）

#：药物组与KCl组比较差异显著（P＜0．05）；##：药物组与KCl组比较差异极显著（P＜0．01）

组别 ［Ca2＋］i对照组224．98±3．54 KCl组 423．07±3．23赛拉嗪低剂量组 440．92±4．87#赛拉嗪高剂量组 447．54±4．55##

由表1数据可知，阴性对照组脑神经细胞钙离子荧光强度最低；加入50mmol／L KCl刺激后细胞的静息状态被打破，产生动作电位，钙离子内流引起神经细胞内钙离子荧光强度增加；在脑神经细胞悬液中加入KCl刺激后再分别加入浓度为15μmol／L和60μmol／L的赛拉嗪，均引钙离子荧光强度不同程度的增加，赛拉嗪低剂量组与KCl组相比显著增加（P＜0．05）；赛拉嗪高剂量组与KCl组相比极显著增加（P＜0．01）。

3 讨论

Fluo－3／AM为一新型、可激发出可见光的钙荧光指示剂，较易负载染色至细胞内，对游离钙离子敏感性高，可连续动态监测钙离子浓度的变化，克服了Fura－2测钙时易受紫外光激发所致其他络合物发光的干扰，能更准确地反映钙离子浓度的变化。

本试验用高浓度的KCl溶液（50mmol／L）刺激大脑皮质神经细胞，打破细胞静息状态，细胞去极化，外钙内流造成 ［Ca2＋］i升高。一般认为高钾能打开神经细胞膜上电压依赖性钙通道，引起细胞外钙内流，导致［Ca2＋］i升高。李明等在胰酶分离的神经细胞，用Fura－2检测出了这种动态变化，加入电压依赖性钙通道阻断剂Nifedipine和Verapamil，则能阻断高钾引起的［Ca2＋］i升高，从而证实了高钾致［Ca2＋］i升高是细胞外钙通过电压依赖性钙通道内流的结果，不涉及其他钙通路［6］。

在高钾刺激神经细胞后使用低剂量和高剂量赛拉嗪，都进一步使神经细胞［Ca2＋］i不同程度的增加，而且呈剂量依赖性，这可能与抑制钙移除机制有关。有报道认为，全麻药能诱导胞内Ca2＋浓度的增加，一方面源于使细胞内储存钙的释放，另一方面可能是抑制膜 Ca2＋－ATP泵，导致胞内Ca2＋积聚［7］。胞内Ca2＋浓度的增加可能通过激活钾通道增强GABA介导的电流抑制钙通道和NMDA受体电流降低受体的活性，从而抑制突触后受体和兴奋性神经递质释放［8］。二甲苯胺噻唑与赛拉嗪同属α2－肾上腺素能受体激动药，有报道称，二甲苯胺噻唑明显地抑制大鼠大脑皮质、小脑、海马和脑干突触体Ca2＋－ATP酶的活性，并且其抑制作用呈现出明显的剂量依赖性增强趋势。Ca2＋－ATP酶的活性受到抑制，致使这种调节功能失调。多余的膜内Ca2＋不能及时转运至膜外，导致［Ca2＋］i浓度升高，钙稳态失衡。从而影响神经细胞动作电位的产生与兴奋性的传导，产生一定的中枢抑制效应［9］。临床相关浓度异丙酚能使神经细胞内［Ca2＋］i短暂性升高，胞内Ca2＋能介导麻醉药对GABA受体的作用，胞内Ca2＋升高能增加K＋的电导，使脊椎动物的神经细胞发生超极化，致使动作电位减弱而产生中枢抑制效应［10］。细胞内的Ca2＋浓度升高还能引起乙酰胆碱的释放。乙酰胆碱作用于抑制性M胆碱受体，引起K＋通道开放和细胞膜超极化，产生抑制作用；乙酰胆碱浓度的增高，作用于肾上腺素能神经末梢突触前膜的 M受体，M受体兴奋，从而抑制肾上腺素能神经末梢释放NE，产生抑制作用［11］。

本试验表明，赛拉嗪增加大鼠大脑皮质神经细胞游离钙离子浓度，且随着赛拉嗪剂量增加而增加，引起钙离子浓度增加的可能机制是抑制钙移除机制，胞内［Ca2＋］i的积聚，导致钙稳态失衡，从而影响神经冲动的传导或者使NMDA摄取减弱，进而达到中枢抑制效应，提示Ca2＋可能是赛拉嗪全麻作用的靶位之一。

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