恒河猴结核病的病理组织学诊断

王 衡，远立国，乔宏胜，宁章勇，李守军

（华南农业大学兽医学院，广东 广州510642）

结核病是一种重要的慢性、消耗性人兽共患病。其病原为分支杆菌，目前可以引起人兽共患的分支杆菌主要有结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、牛分支杆菌（Mycobacterium bovis）和禽分支杆菌（Mycobacterium avium）。

流行病学调查表明，野生动物结核病发病率具有逐年升高的趋势。其中，牛分支杆菌感染谱较广，如野猪［1］、羚羊、长颈鹿、美洲狮、野鹿［2－3］和狼［4］等均有感染的可能；大象可以结核分支杆菌［5］感染；鸟类对禽分支杆菌易感，同时对结核分支杆菌具有较强的抵抗力。众多野生动物中，非人灵长类对以上3种分支杆菌均易感，其中猴子对其易感性尤为明显［6］。研究表明，在非人灵长类动物中分支杆菌的分离率可达70%以上，其中大部分分离自猴子。国内有报道称，在圈养结尾狐猴［7］和猕猴［8］群中曾暴发过结核病，同时猕猴和恒河猴感染结核菌后可以出现与人类相似的临床症状和病理特征，因此这两种动物常用来作为人类结核病的动物模型［9］。由于结核菌可以通过呼吸道和消化道行进传播，野生动物感染后，不但能够在种群中传播，还会传染给其他动物，研究表明，动物园内携带结核分支杆菌的猴子可能传染动物园内的工作人员。因此，对结核病进行及时的诊断和防治，对于保证动物的健康和人类安全具有重要的作用。

为进一步掌握猴结核病的病理组织学特征及其病原类型，本文将采用传统病理组织学方法和PCR技术，对1例疑似猴结核病群发病例进行诊断，结果表明，该猴群感染了牛分支杆菌，该结果将为猴结核病流行病学及病理学研究提供参考依据。

1 研究方法

1．1 切片观察 恒河猴养殖单位送检病死恒河猴心脏、肝脏、脾脏、肾脏等脏器，送检病料经100mL／L中性福尔马林溶液固定，使用LEICA RM2145型切片机进行常规石蜡切片，苏木素－伊红染色（hematoxylin－eosin stain，H．E．），应用ZEIZZ Axioskop2 plus光学显微镜观察组织学变化。

1．2 DNA抽提 取少量组织病料，采用常规DNA抽提方法提取DNA经液氮处理研磨后，加入700 μL TE（10mol／L Tris－HCl，1mmol／L EDTA，pH值为8．0）溶液，打匀；加入200g／L SDS溶液150 μL，打匀；加入20mg／μL蛋白酶 K 20μL；打匀后50℃摇床温育3h。温育结束后加等量的酚／氯仿／异戊醇混合物（酚／氯仿∶异∶戊醇＝25∶24∶1），充分混匀，12 000r／min离心10min，取上清液，如此重复2～3次。向上清中加入2倍体积的无水乙醇，室温沉淀30min，12 000r／min离心10min，弃上清。沉淀用750mL／L乙醇洗涤1次，风干后用100μL TE溶解，作为PCR模板，－20℃保存。

1．3 多重PCR检测 参考本实验室乔宏胜硕士建立的3种分支杆菌多重PCR检测方法，通过比对GenBank提供的结核分支杆菌、牛分支杆菌及禽分支杆菌参考序列，分别选取差异明显的结核分支杆菌RD10片段、牛分支杆菌moaB3片段和禽分支杆菌12－23SrDNA片段作为候选基因，用以区分三者。所用引物相关信息见表1。

以1．2制备DNA样品为模板，使用3对引物，应用ABI 9700型PCR仪进行常规多重PCR反应，反应结束后，通过10g／L琼脂糖凝胶电泳进行结果分析。

同时参照GenBank提供的牛分支杆菌TbD1基因设计特异性引物，上下游引物序列分别为：5′－TGGGCAGTCGTTTCGGTTGT－3′、 5′－CGGTGGCGGGCATGTAAT－3′，预期PCR 产物大小为192bp。对疑似样品进行特异性PCR检测，再次对多重PCR检测结果进行确认。

2 结果

2．1 病理组织学观察 本文主要针对送检病死动物的肝脏、脾脏、肾脏及心脏进行了病理组织学观察，结果如下。

肝脏：肝组织内可见体积大小不等的传染性肉芽肿结构，体积较小的呈现为粟粒状（见图1B），体积较大的呈现为结节状，结节状肉芽肿内部可见干酪样坏死，部分坏死灶内已经发生钙化（见图1A）。坏死灶外围分布有明显的上皮样细胞及多核巨噬细胞，并伴有少量淋巴细胞浸润，周围肝细胞发生严重的变性坏死。粟粒性肉芽肿主要以巨噬细胞浸润和肝细胞变性坏死为主。

表1 3种分支杆菌多重PCR检测方法所用引物

图1 猴肝脏、脾脏、肾脏和心脏的病理组织学观察

有的肉芽肿以胆管为中心，表现为胆管上皮细胞坏死脱落，胆管周围结缔组织、纤维组织和巨噬细胞增生明显，同时伴有淋巴细胞浸润（见图1C）。肝脏汇管区中等静脉内膜细胞肿胀、变性、坏死脱落，并可见有特别明显的肉芽肿结构（见图1D）。

脾脏：脾脏内同样可见大量的体积大小不等的传染性肉芽肿结构，体积较大者内部发生干酪样坏死（见图1E）。肉芽肿周围分布有密集的上皮样细胞和特别明显的多核巨噬细胞。脾脏固有结构受到挤压，网状内皮细胞发生脂肪变性并伴有坏死，脾脏支持组织发生纤维素样坏死（见图1F）。

肾脏：肾脏间质内可见有粟粒性传染性肉芽肿，肉芽肿结构内主要分布有巨噬细胞、多核巨噬细胞和淋巴细胞，肉芽肿周围肾小管上皮细胞坏死脱落（见图1G）。

心脏：心脏主要表现为心外膜淤血、出血，心肌萎缩、断裂、坏死，心肌出血（见图1H），心内膜乳头肌内可见有肉芽肿结构并伴有淋巴细胞浸润（见图1I），部分乳头肌坏死。

2．2 PCR反应检测分析 多重PCR检测结果显示，多条泳道在297bp处出现明显的特异性条带，而在954bp和119bp处未见明显条带出现，表明该病原为牛分支杆菌，而非结核分支杆菌或鸟分支杆菌（见图2）。

图2 多重PCR检测结果

为进一步证明其病原类型，针对牛分支杆菌TD1基因片段设计特异性引物，进行PCR反应，最终获得大小为190bp左右的特异性片段，与预期片段大小一致（见图3）。以上两种PCR检测结果表明，引起该猴结核病的病原应为牛分支杆菌。

3 讨论

本试验检测样品为圈养病死恒河猴病料，该恒河猴养殖场在短时间内多只幼龄恒河猴出现呼吸困难，食欲下降，机体消瘦，精神委靡，被毛蓬乱，最终衰竭死亡。剖检时可见全身淋巴结肿大，肺脏、肝脏、脾脏切面可见白色、灰白色结节状病灶。对送检样品进行病理组织观察发现，在肝脏、脾脏、肾脏和心脏中都可见面积大小不等的肉芽肿结构。其中肾脏和心脏中主要以较小的粟粒性肉芽肿为主；而在肝脏和脾脏中可见面积较大的结节性肉芽肿，其内部伴发干酪样坏死，有时可见钙化灶出现。结合临床症状、剖检变化和病理组织学观察，初步诊断为疑似猴结核病。

图3 牛分支杆菌特异性PCR检测结果

由于该病例发病日龄较小，发病速度较快，并在全身多个器官内发现形态典型的传染性肉芽肿结构，因此推断该猴群可能为初发性结核。另外，剖检时可见肺结核及淋巴结肿大，同时在静脉内膜、心脏乳头肌和肾脏中可见粟粒性结核，由此推断，该结核可能通过管道蔓延、淋巴源性蔓延和血源性蔓延3种途径在体内不断扩散。

为进一步确认病理组织学诊断结果，本试验相继采用多重PCR和特异性PCR方法对样品进行检测。该多重PCR反应可用于区分结核分支杆菌、牛分支杆菌和禽分支杆菌3种分支杆菌，检测结果表明，该结核病病原应为牛分支杆菌。同时采用针对牛分支杆菌TD1基因片段特异性引物，进行再次检测，以确认多重PCR结果。两种PCR结果表明，该病例为非人灵长类感染牛分支杆菌病例，进一步证明恒河猴具有感染牛分支杆菌的可能。有试验表明，猴对3种分支杆菌均易感，而究竟哪种最易感、哪种对猴致病性最强，暂时还没有明确的记载。本诊断结果再次证明恒河猴可以感染牛分支杆菌，对于恒河猴初次感染病例，牛分支杆菌对其具有较强的致病性，尤其是幼龄猴，可以在短时间内蔓延至全身多个器官，并最终引起死亡。

本诊断结果仅对该病例进行了病原性诊断，病死猴群如何感染牛分支杆菌，还需对猴群免疫情况、繁殖背景以及养殖环境进行进一步的分析和探究。

［1］ Schmidbauer S M，Wohlsein P，Kirpal G，etal．Outbreak of Mycobacterium bovis infection in a wild animal park［J］．Vet Rec，2007，161（9）：304－307．

［2］ Martin－Hernando M P，Torres M J，Aznar J，etal．Distribution of lesions in red and fallow deer naturally infected with Mycobacterium bovis［J］．J Comp Pathol，2010，142（1）：43－50．

［3］ Gortazar C，Torres M J，Vicente J，etal．Bovine tuberculosis in Donana Biosphere Reserve：the role of wild ungulates as disease reservoirs in the last Iberian lynx strongholds［J］．Plos One，2008，3（7）：e2776．

［4］ VerCauteren K C，Atwood T C，DeLiberto T J，etal．Surveillance of coyotes to detect bovine tuberculosis，Michigan［J］．Emerg Infect Dis，2008，14（12）：1862－1869．

［5］ Montali R J，Mikota S K，Cheng L I．Mycobacterium tubercu－losis in zoo and wildlife species［J］．Rev Sci Tech，2001，20（1）：291－303．

［6］ 王彭军．猴结核病［J］．中国人兽共患病杂志，2000，16（3）：89－90．

［7］ 徐广贤，郝俊峰，尹晓敏，等．节尾狐猴暴发结核病的诊断［J］．中国兽医杂志，2007，43（9）：59．

［8］ 贾建军，王卫红，程浩，等．猕猴结核病的诊断［J］．中国兽医杂志，2004，40（3）：53．

［9］ Capuano S V，3rd，Croix D A，Pawar S，etal．Experimental Mycobacterium tuberculosis infection of cynomolgus macaques closely resembles the various manifestations of human M．tuberculosis infection［J］．Infect Immun，2003，71（10）：5831－5844．