番茄红素抗氧化应激效应对大鼠脊髓损伤后运动功能恢复的影响①

李晓，罗晨禹，杨拯，谢少华，张尧，杨海燕，马延仃，张艺，胡雯思，卓睿，李亚光

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种严重危害人类中枢神经系统的疾病，致残率和死亡率都很高。据统计，每年大约新增30万脊髓损伤患者。因此，我们必须开展基础研究，以期为脊髓损伤的临床治疗提供新思路和新方法。脊髓损伤的主要病理改变包括由原发性损伤导致出血、缺血和缺氧等引起的一系列继发性损伤，如Ca2+聚集、兴奋性氨基酸的释放、大量自由基产生、脂质过氧化反应、炎症反应和细胞凋亡等[1-3]。而这些继发性损害是加重脊髓神经功能丧失的关键因素。因此，在脊髓损伤早期，有效地控制脊髓的继发性损伤是一个重要的研究方向。

研究表明，氧化应激效应在脊髓损伤的病理改变中发挥重要作用，与脊髓损伤时脊髓及脊髓所支配区域的损伤有密切的联系[4]。番茄红素(lycopene,LP)是一种开链式的不饱和类胡萝卜素，属于天然脂溶性色素，它具有极强的抗氧化和清除自由基的能力，其抗氧化性能在天然类胡萝卜素中最强[5-6]。

本实验采用测定脊髓损伤模型血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和后肢运动功能评价的方法，探讨番茄红素对脊髓损伤后大鼠运动功能恢复的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康、清洁级成年Sprague-Dawley大鼠36只，雌性(雌性大鼠尿道短，尿道感染、水肿发生概率低，不易形成尿道阻塞，有利于脊髓损伤术后护理，可提高术后大鼠生存率)，体重(230±20)g，由四川大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(川)-10-2006。将36只大鼠按Allen法造脊髓损伤模型后随机分为3组：对照组(A组)、甲泼尼龙琥珀酸钠治疗组(B组)和番茄红素治疗组(C组)，每组12只。每组再随机按1 d、3 d、7 d分成3个亚组，每个时间点4只。

1.2 主要试剂和仪器

6%番茄红素油树脂(新疆瑞德莱福生物科技有限公司)，批号：HY1007261；注射用甲泼尼龙琥珀酸钠(天津药业焦作有限公司)，批号：10031501；戊巴比妥钠(德国进口分装，北京化学试剂公司)，批号：100808；注射用青霉素钠(瑞阳制药有限公司)，批号：10013101；氯化钠注射液(安徽双鹤药业有限责任公司)，批号：110120 2E；丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)，批号：20111217。超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所)，批号：20111217；自制数字式脊髓损伤动物模型制备仪；TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；721E型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)。

1.3 模型制备

选取正常Sprague-Dawley大鼠，用1.5%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，俯卧位固定，背部去毛，常规消毒铺巾。以T9棘突为中心做背部正中切口，长约2 cm，然后用手术刀紧靠棘突两边切开背部肌肉，明确T9的位置，接着小心去除T9椎骨上的肌肉。之后进行椎板切除术，先用有齿镊剥离T9棘突和椎间软组织，再用无齿镊小心剥开锥板，并适当修剪两侧锥板，充分暴露脊髓，用自制数字式脊髓损伤动物模型制备仪打击器制成脊髓损伤模型，打击强度为10 g×25 mm，打击后即刻见鼠尾痉挛性摆动，双后肢及躯体发生不同程度抽搐，随后完全松弛，标志模型制备成功，之后逐层缝合切口。由于手术过程中有一定出血而使大鼠血容量减少，术后立即以9 ml/kg腹腔注射氯化钠注射液，并腹腔注射青霉素以防感染，待动物清醒后放回饲养笼中饲养。术后大鼠自由饮水、进食，保持适宜室温和湿度，定时清洁笼具，并保持大鼠身体干燥，每天挤压膀胱排尿3次，直至恢复自主排尿；术后连续3 d每天腹腔注射青霉素8×104U。

1.4 治疗方法

A组：造模成功后不给予任何药物治疗。B组：造模成功后30 min按首次剂量30 mg/kg腹腔注射甲泼尼龙琥珀酸钠，此后按5.4 mg/kg⋅h每6小时注射1次，共4次。C组：造模成功后30 min灌胃溶有番茄红素油树脂的色拉油2 ml(按20 mg/kg番茄红素配制)[7]，此后每天灌胃1次。

1.5 评定方法

每组大鼠按1 d、3 d和7 d亚组进行评定，内容如下。

1.5.1 斜板试验[8]将大鼠置于自制垫有橡胶垫的斜板上，使大鼠身体纵轴与斜板纵轴平行，头朝斜板抬高侧，斜板倾斜角度从0°开始缓慢上升。记录大鼠停留在斜板上维持至少5 s时的最大角度，每次测试3遍，取其平均值。采用双人双盲法，每次评分由熟悉评分标准但与实验无关的人员完成。

1.5.2 BBB评分[9]将大鼠排空膀胱后置于宽大活动场地，采用双人双盲法观察其后肢运动情况，联合考察大鼠后肢各关节活动、后肢的步态和协调功能、运动时爪子的精细运动。取左右两侧肢体评分平均值，作为最后得分。

1.5.3 血清中SOD和MDA测定 大鼠均于行为测试完成后，戊巴比妥钠麻醉，经右心室取血3 ml，立即3000 r/min离心15 min，取上清液，存于-20℃冰箱。SOD和MDA分别采用黄嘌呤氧化法和硫代巴比妥酸检测，操作方法按试剂盒说明进行。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 一般情况

大鼠术后苏醒，静卧少动，气息较微，双后肢运动功能丧失，肌张力降为零，无食欲，不进水，尿失禁或下腹部膨隆，发生尿潴留，呈现不完全性脊髓损伤的表现。术后前3 d，大鼠活动、进食较少，尿潴留比较严重，部分伴血尿及腹部胀气，此后饮食逐渐增加，活动逐渐增多。由于实验期间护理良好，5~7 d后，所有大鼠能够基本恢复自主排尿，且伤口未见感染，身体未出现压疮，36只大鼠均进入结果分析。

2.2 斜板试验

术后1 d、3 d，C组斜板试验评分均高于A组(P<0.05)，7 d无显著性差异(P>0.05)。术后1 d、3 d、7 d，B组斜板试验评分均高于A组(P<0.05)。见表1。

表1 脊髓损伤大鼠斜板评分结果

2.3 BBB评分

术前所有大鼠评分均为21分。术后1 d、3 d、7 d，C组与A组相比，BBB评分均增高(P<0.05)，B组术后1 d、7 d评分明显高于A组(P<0.01)，3 d虽也高于A组，但无显著性差异(P>0.05)。见表2。

表2 脊髓损伤大鼠BBB评分结果

2.4 SOD

术后1 d、3 d、7 d，C组与A组相比，SOD活性升高(P<0.05)。术后1 d，B组SOD活性与A组无显著性差异(P>0.05)；术后3 d、7 d，B组SOD活性升高(P<0.05)。见表3。

表3 脊髓损伤大鼠SOD活性测试结果(U/ml)

2.5 MDA

术后1 d，B组MDA含量较A组降低(P<0.05)，C组与A组无显著性差异(P>0.05)。术后3 d，C组MDA含量低于A组(P<0.05)，但B组与A组无显著性差异(P>0.05)。术后7 d，C组、B组MDA含量均显著低于A组(P<0.001)。见表4。

表4 脊髓损伤大鼠MDA含量测定结果(nmol/ml)

3 讨论

番茄红素是一种开链式不饱和类胡萝卜素，主要存在于番茄、西瓜、葡萄、柚、木瓜、石榴、秋橄榄等植物中，动物机体自身不能合成，只能从食物中摄取。作为一种功能性色素，番茄红素具有多种生物学效应，其中抗氧化作用受到广泛关注。

研究表明，番茄红素的抗氧化性能是天然类胡萝卜素中最强的，抗氧化能力是β-胡萝卜素的2倍，维生素E的100倍[10]。动物实验表明，番茄红素能提高大鼠超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱苷肽过氧化物酶以及谷胱苷肽还原酶的活性，从而提高其抗氧化能力，降低对毒物的敏感性[11]。有报道显示，番茄红素通过其高效猝灭单线氧态和清除自由基的能力，抑制活性氧(ROS)的产生，有效地减少颗粒物对细胞DNA的损伤[12]。Rao等发现食用番茄红素2周后可显著降低体内蛋白、脂类和脂蛋白的氧化损伤[6]。Porrini等的实验表明，在给一组成年女性补充番茄红素后，淋巴细胞抗氧化应激效应能力显著增强[13]。因此多食用富含番茄红素的食品对保持人体健康很有益处。

国内外学者研究发现，番茄红素还可以对抗大鼠缺血再灌注脑组织损伤、动脉粥样硬化、大鼠急性肺损伤、H2O2诱导的成骨细胞损伤、小鼠肝纤维化、癌细胞增殖等。这些都与番茄红素的抗氧化和清除自由基的能力有关。综上所述，番茄红素可以通过其高效猝灭单线氧态和清除自由基的能力，抑制活性氧的产生，清除自由基，减少脂质的过氧化，减轻细胞的氧化程度来直接保护细胞。

众所周知，脊髓损伤后的治疗仍为世界医学界的难题。近年来，国内外学者对脊髓损伤的损伤机制进行了广泛的探讨和研究，认识到脊髓损伤在原发损伤的基础上发展一系列的进行性病理改变，而这种继发性的病理改变将加重脊髓损伤，甚至造成脊髓的不可逆伤害[14]。大量研究显示，脊髓损伤后氧化应激反应是引起脊髓组织继发性损伤的主要因素之一[15]。因为脊髓损伤后产生并释放大量的氧自由基[16]，而脊髓神经元细胞膜结构中含有丰富的脂质，所产生的氧自由基性质极不稳定，能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应，破坏膜结构的通透性与完整性，导致细胞变性坏死。SOD是细胞内主要的抗氧化酶和自由基清除剂，能保护细胞对抗氧自由基的侵害，其水平的高低，反映出内源性氧自由基清除系统功能的强弱[17]。MDA是脂质过氧化的最终产物，测定MDA含量可直接反映体内氧自由基生成水平，其含量高低是组织细胞损伤的重要标志[18]。因此，通过MDA含量和SOD活性的测定可以间接反映体内抗氧化应激效应的能力。

本研究结果显示，番茄红素能显著提高脊髓损伤模型血清中SOD水平，抑制MDA产生，有效对抗氧自由基介导脂质过氧化反应，减轻脊髓损伤后自由基对脊髓血管及神经细胞等的继发损伤，发挥其对脊髓损伤保护和治疗作用，从而有效促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复。本实验为番茄红素临床应用提供了理论基础，但它对脊髓损伤的治疗效果是否呈剂量依赖尚不清楚。有报道显示，在高浓度下，番茄红素清除自由基的能力丧失，推测是由高浓度时形成更多的番茄红素过氧化基团以及番茄红素自氧化速度加快造成[19]。因此，探索番茄红素治疗脊髓损伤的最佳剂量，还需更全面和深入的研究。

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