电针对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑内血管内皮生长因子受体-2 mRNA和脑源性神经营养因子蛋白表达的影响

马璟曦，罗勇，蔡敏

脑缺血损伤修复再生过程存在着两个不同方面：神经发生和血管生成。它们在缺血后同时被启动，并被精密、协调、统一地调控。脑缺血后“神经发生-血管生成”之间可能存在密切联系和相互作用。研究发现，神经或血管产生的神经血管因子[1]如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)等在神经发生和血管生成过程中相互作用，在脑缺血后协调地表达。在本课题组原有研究基础上[2]，本研究进一步探究电针干预后大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑内血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2)、脑源性神经营养因子(brain-de-rived neurotrophic factor,BDNF)的表达。

1 材料与方法

1.1 实验分组

健康成年雄性Wistar大鼠90只，体重250～300 g。由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(渝)20020002。

随机分为对照组(n=6)、模型组(局灶性脑缺血再灌注，n=42)、电针组(局灶性脑缺血再灌注+电针，n=42)。后两组局灶性脑缺血1 h后分别于2 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d、21 d共7个时相点再灌注，每个时相点6只。

1.2 模型制备

模型组和电针组采用线栓法制备右侧大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)模型。3.5%水合氯醛(1 ml/100 g)腹腔注射麻醉，大鼠仰卧位固定，经颈部正中切口依次暴露颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉颅外段。在颈外动脉残端做一环形切口，将预先处理的栓子向颈内动脉颅内方向插入17～20 mm，如遇阻力，表明线栓头部已通过大脑中动脉起始部，停止进线，结扎。1 h后拔回线栓至颈外动脉的残端，实现再灌注。模型成功的判断标准[3]：①左侧肢体疼痛回缩迟钝或不出现；②行走时向左侧偏倒或原地向左侧旋转；③提尾倒悬时左上肢不向前下伸；④右侧出现Honer征。

1.3 电针刺激方法及参数

对照组和模型组不做特殊处理。电针组参照中国针灸学会实验针灸委员会实验动物穴位图谱，选取双侧合谷穴(LI 4)为电针穴位。局灶性脑缺血后45 min，电针刺激上述穴位，15 min/次。刺激参数：疏密波F1=40 Hz，F2=60 Hz，空载输出电压1.5 V。对超过1 d的时相点，每日电针1次，7 d后自然喂养，不做特殊处理。

1.4 VEGFR-2 mRNA检测

本课题组前期研究提示，电针组和模型组与对照组比较，VEGF mRNA表达在12 h增加，24 h达高峰，3 d后开始下降[2]。本实验采用反转录酶-聚合酶链锁反应(RT-PCR)检测VEGFR-2 mRNA，选择12 h、24 h、3 d三个代表时间点来研究。引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，VEGFR-2 mRNA序列号X13412。①扩增大鼠VEGFR-2 mRNA上游引物序列：5'-CAAAGCAAGTCA TCA CCAAG-3'，下游引物序列：5'-AAG CCA GAA GAT GAA TACACT C-3'，扩增片段长度为557 bp；②扩增大鼠β-actin mRNA(内参照)上游引物序列：5'-GAC TAC CTC ATG AAG ATC CT-3'，下游引物序列：5'-GCG GAT GTC CAC GTCACA CT-3'，扩增片段长度为313 bp。无酶条件下准确称取100 mg缺血脑组织，采用Trizol提取试剂盒(Invitrogen公司)提取RNA。并用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。取1μl RNA逆转录为cDNA，35个循环进行PCR反应，再制胶、上样、电泳，观察结果，运用Bio-Rad凝胶成像系统摄像。

1.5 取材

各时间点大鼠麻醉后用生理盐水200 ml快速左心室灌注冲洗，再用4%多聚甲醛(pH 7.4的0.1 M PBS配置，加0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)500 ml先快后慢灌注固定，断头取脑，制备石蜡切片。取相邻的切片用于免疫组化。

1.6 BDNF免疫组化检测

切片脱蜡至水，抗原热修复92～98℃15 min，滴加封闭液，滴加1∶100兔多克隆BDNF抗体(Santa Cruz公司)4℃过夜，滴加SABC。DAB显色、脱水、透明、封片。

1.7 结果判定

VEGFR-2 mRNA RT-PCR结果判定：将电泳结果用Quantity One 4.3.1系统扫描，测定各条带绝对积分光密度(optical density,OD)值，结果以mRNA相对值表示。

BDNF免疫组化阳性细胞计数：在400倍视野下计数，以胞浆染成棕黄色为阳性细胞。每只动物随机选取3张非连续切片，每张切片取10个不连续视野的均值。

1.8 统计学分析

每组数据用(±s)表示，用SPSS 12.0软件进行t检验，显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 VEGFR-2 mRNA RT-PCR结果

模型组VEGFR-2 mRNA相对值从再灌注后12 h到3 d均较对照组显著增加(P<0.001)，再灌注后24 h达到高峰，这和本课题组既往报道的VEGF mRNA[2]表达高峰基本吻合。再灌注后3 d开始下降，但仍显著高于对照组(P<0.001)。电针组VEGFR-2 mRNA相对值从再灌注后12 h到3 d均较对照组显著增加(P<0.001)，再灌注后24 h达到高峰。电针组再灌注后12h、24 h VEGFR-2 mRNA明显高于模型组(P<0.01)，电针组再灌注后3 d也高于模型组(P<0.05)。见表1。

表1 各组VEGFR-2 mRNA的表达(mRNA相对值)

2.2 BDNF蛋白免疫组化

对照组：见少量BDNF蛋白表达，着色较淡，分布于大脑皮质及海马等部位。

模型组：与对照组比较，海马区BDNF蛋白表达在再灌注后2 h增加(P<0.05)，12 h继续增加(P<0.001)，再灌注后24 h达高峰(P<0.001)，14 d仍高于对照组(P<0.001)。见图1、表2。

电针组：与对照组比较，海马区BDNF蛋白表达在再灌注后2 h开始显著增加(P<0.001)，24 h达高峰(P<0.001)，直到14 d仍有显著性差异(P<0.05)；与模型组比较，海马区BDNF蛋白表达在再灌注后2 h开始增加(P<0.05)，再灌注后24 h达高峰(P<0.01)，3 d后增加仍有显著性差异(P<0.05)，但呈现增加幅度降低的趋势。细胞浆染成棕黄色，强阳性细胞主要在缺血半球，尤其是病灶周围，在血管内皮细胞和神经元都有表达，分布范围广泛。见图2、表2。

图1 模型组海马BDNF蛋白再灌注24 h时的表达(400×)

图2 电针组海马BDNF蛋白再灌注24 h时的表达(400×)

表2 各组BDNF蛋白阳性细胞数

3 讨论

3.1 神经血管单元[4]和神经血管因子

卒中后神经修复再生过程包括神经发生、血管新生以及突触发生和轴突生长[5]。神经干细胞的小生境(niche)中的血管微环境对神经发生调节起至关重要的作用[6]。既往缺血性脑血管病的研究较注重神经细胞，而对血管内皮细胞的关注相对不够。脑缺血后神经和血管的相互联系作用是现在脑卒中研究的热点之一。神经血管单元[4]由神经元-胶质细胞-血管构成，包括神经元、星形胶质细胞、小角质细胞、血管内皮细胞、血管周细胞、基底膜以及细胞外基质。这个概念强调细胞与细胞之间、细胞与基质之间的相互作用和动态平衡，以动态的观点全面反映缺血后的病理生理过程，为治疗缺血性脑血管病开拓了新的视野。

神经血管因子[1]和神经血管单元有着十分密切的关系。既往实验表明，一些经典的血管生长因子，如VEGF[7]、血管生成素[8]等，也具有刺激神经发生或神经保护的作用。而一些传统的神经营养因子，如BDNF[9]等，也具有增加血管新生或引导血管出芽等作用。这些作用于神经和血管的生长因子统称为神经血管因子。对神经血管因子的研究可以深化对神经血管单元的认识。神经血管因子为神经发生与血管生成的联系及作用提供了可能的分子学基础。因此，重新认识VEGF、血管生成素、BDNF等神经血管因子在脑缺血后的神经功能恢复中的作用十分必要。

3.2 脑缺血和神经血管因子

研究脑缺血后VEGF、BDNF作用的文献报道很多，但是从神经血管因子这一新的角度切入更能深入、系统、全面地了解这些因子在脑缺血后修复再生中的作用。在缺血性脑血管病的临床治疗中把神经发生和血管生成结合起来，促进神经血管单元的协调和优化，是今后努力的方向。

本课题组前期研究发现局灶性脑缺血再灌注后VEGF、血管生成素-1的表达增加[2]。本实验发现，局灶性脑缺血再灌注后VEGFR-2、BDNF不仅在缺血半暗带表达，而且在远离缺血区的侧脑室、海马、纹状体等部位表达；不仅在神经细胞、神经胶质细胞表达，而且在血管内皮细胞表达。这些结果初步提示，神经血管因子表达部位广泛，其可能的作用途径和机制也是多种的。

研究表明，VEGF/VEGFR系统[10]可能在血管新生的早期发挥关键性作用，是整个脑缺血后血管新生调控的中心环节。VEGFR-2是内皮细胞上VEGF的主要受体类型。VEGF通过VEGFR-2发挥强大的血管效应，包括增加微血管通透性，刺激内皮细胞增生、入侵、迁移、存活等多个方面[11]。VEGF刺激神经发生的可能机制是[12]：①VEGF通过促进血管小生境的建立刺激神经前体细胞的增生和分化；②VEGF通过刺激内皮细胞释放促进神经发生的特异性信号，如BDNF；③VEGF作为一个直接的促有丝分裂原引起神经前体细胞增生。脑缺血后神经母细胞表达VEGFR-2，并沿血管迁移。VEGFR-2介导的信号通路在促进脑缺血后神经血管重塑及其联系神经发生和血管生成中起关键作用[13]。本课题组发现局灶性脑缺血再灌注后VEGF/VEGFR-2表达均增加。本实验观察到VEGFR-2 mRNA相对值从再灌注后12 h到3 d均较对照组显著增加，再灌注后24 h达到高峰。提示局灶性脑缺血再灌注后VEGF/VEGFR-2表达增加可能有助于神经血管单元的重建。

BDNF可以在脑血管内皮细胞上表达，并通过旁分泌和自分泌作用于中枢神经系统的血管[14]。BDNF增加锰超氧化物歧化酶(MnSOD)的表达来促进内皮细胞抗氧化能力[15]，促进内皮细胞存活和诱导缺血组织的血管生成[16]。本实验观察到BDNF蛋白表达在再灌注后2 h明显增加，24 h达高峰，14 d仍较对照组有显著性差异。提示神经血管因子BDNF在脑缺血后表达增加可能有助于神经功能的恢复和血管生成。

3.3 电针和神经血管因子

既往研究表明，电针结合经颅磁刺激[17]和电针[18]可以促进脑缺血大鼠BDNF及mRNA表达。电针增加大鼠脑缺血再灌注后骨髓及外周血中VEGF浓度，VEGF作用于内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)表面的VEGFR-2，加速EPCs动员和迁移[19]。

本课题组既往研究发现，电针合谷穴可能通过上调血管生长因子VEGF、血管生成素-1和下调血管抑制因子的表达[2]，上调胎盘生长因子及其受体Flt-1的表达[20]来促进局灶性脑缺血再灌注后的血管新生；上调基质衍生因子(SDF)-1α的表达来促进局灶性脑缺血再灌注大鼠外周血EPCs、趋化因子受体4+(CXCR4+)细胞和骨髓EPCs数量增加[21]；并通过上调碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)来促进神经干细胞的增殖、迁移[22]。提示电针对“神经血管单元”具有“整体的良性调节”作用。电针能有效治疗缺血性脑血管病可能与“整体调节”神经血管因子的表达有关。本实验观察到，电针刺激VEGFR-2 mRNA、BDNF蛋白表达较模型组更加明显。本实验还发现电针对整个VEGF/VEGFR系统都有明显激活作用。电针对脑缺血可发挥多环节、多水平、多层次、多途径的调节作用，有利于全面促进整个脑缺血后的血管新生和神经功能恢复。

目前仍有一些问题值得进一步的探索研究，如电针对神经血管单元的整体作用起决定性作用的因素；电针对各种神经血管因子表达的时空变化影响及它们的相互作用；它们对神经血管单元的各种组成成分的作用。另一个值得关注的现象是，本实验电针刺激最多只有7 d，但7 d以后，甚至再灌注后21 d后神经血管因子BDNF的表达仍高于模型组，提示电针治疗效果持续时间较长，作用更持久。而既往实验对停止电针刺激后的血管生长因子的表达情况关注较少。还需要进一步观察和研究。

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