胃腺癌组织中NET-1、FHIT及Ki-67的表达及其临床意义

栗一帆， 王晓娟， 马晋峰

胃癌的发生、发展是多种原癌基因的活化和多种抑癌基因的失活而造成的，是多种遗传改变累积的结果［1］。NET-1是一种属于四聚体超家族成员的肿瘤增殖相关蛋白，在胃癌中呈阳性表达，NET-1在胃癌组织中的表达国内外少见报道，且缺乏大样本量的随访观察［2］。Ki-67是一种公认的与细胞增殖相关的核抗原，主要用于判断细胞的增殖活性。FHIT基因是一个抑癌基因，其抑癌机制可能与抑制细胞增殖及参与细胞周期调控有关［3］。FHIT基因的缺失、异常转录和异常蛋白的表达和胃癌的发生发展密切相关。本研究通过检测胃腺癌组织中NET-1、FHIT、Ki-67的表达情况，研究 NET-1和Ki-67在胃癌中的表达是否具有一致性，并观察三者表达对患者生存预后的影响，为研究胃腺癌的发展、转移及预后提供可靠的理论依据。

1 资料和方法

1.1 临床资料

我科2004年5月至2005年1月共手术治疗88例胃腺癌患者，其中男59例，女29例;年龄43～81岁，平均60.1岁;病理诊断均为腺癌，高分化癌10例，中分化癌34例，低分化癌44例;临床分期Ⅰ期8例，Ⅱ期17例，Ⅲ期43例，Ⅳ期20例。88例患者均无慢性肝病及肝肾功能不全病史，无放、化疗史，B超及CT检查未见远处转移灶。术中亦未发现明显转移灶。切除后的所有标本均经10%福尔马林固定后保存。

1.2 试剂与仪器

免疫组化染色试剂盒、NET-1抗体(工作浓度1∶200)购于美国 ZYMED公司，鼠抗人Ki-67抗体(工作浓度1∶100)，兔抗人FHIT单克隆抗体(工作浓度1∶50)购自北京中杉金桥生物有限公司。仪器包括LEICA RM2135切片机(上海莱卡仪器有限公司)，光学显微镜(日本Olympus)，隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)。

1.3 方法

1.3.1 检测方法 免疫组化二步法:4 μm石蜡切片脱蜡至水。高压热抗原修复，PBS冲洗，每张切片滴加1滴过氧化物酶阻断剂，室温10 min，阻断内源性过氧化物酶。后经非免疫动物血清封闭，滴加一抗，4℃冰箱过夜。滴加生物素标记的第二抗体和辣根过氧化物酶标记的卵白素，室温下各孵育10 min。DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片。

1.3.2 阳性标准的判断 NET-1免疫染色阳性定位于胃癌细胞胞浆或胞膜，细颗粒状。FHIT免疫染色阳性定位于胃癌细胞胞浆，呈棕黄色颗粒。Ki-67阳性定位在胃癌细胞核。结果的判定采用双盲法，由两位有临床经验的病理科医生对免疫组化结果进行判读。将染色强度和阳性细胞数二者结合判断染色结果。

1.3.3 术后生存时间的收集 术后第1年每3个月随访1次，术后2～5年每6个月随访1次。本研究生存时间收集截至2010年1月。

1.3.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件处理，率的比较采用χ2检验，平均术后生存时间的比较采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 NET-1、FHIT及Ki-67在胃腺癌组织中的表达

NET-1、FHIT主要表达在腺癌的细胞浆(图1～2)。Ki-67阳性细胞表达在腺癌的细胞核(图3)。NET-1、FHIT及Ki-67在胃腺癌组织中的检出率分别为 47.7%(42/88)、40.9%(36/88)及 88.6%(78/88)，见表1。

图1 NET-1在胃腺癌组织中的表达(×40)

图2 FHIT在胃腺癌组织中的表达(×40)

图3 Ki-67在胃腺癌组织中的表达(×40)

表1 3种基因在不同分化程度胃腺癌组织中的阳性表达率

2.2 胃腺癌组织中NET-1、FHIT及Ki-67的表达与预后的关系

NET-1、FHIT及Ki-67阴性表达组患者的平均术后生存时间分别为65.1、26.9、70.1 个月，阳性表达组患者的平均术后生存时间分别为26.6、39.2、30.1个月(见表2)。NET-1和Ki-67阳性表达患者的术后生存时间短于阴性组(P＜0.05)，见图4、5;FHIT阳性表达患者的术后生存时间长于阴性组(P＜0.05)，见图 6。

表2 胃腺癌组织中NET-1、FHIT、Ki-67的表达与预后的关系

图4 NET-1阳性组与阴性组术后生存曲线比较

图5 Ki-67阳性组与阴性组术后生存曲线比较

图6 FHIT阳性组与阴性组术后生存曲线比较

3 讨论

NET-1基因定位于 lp341，其 mRNA全长为1297 bp，编码序列为128～853 bp，有241个氨基酸的开放阅读框。在 240、692、944、1100、1126 bp 存在变更。NET-1 polyA的位点在1278 bp(基因库登记号码AF065388)。NET-1作为新的四聚体超家族的成员在细胞信号转导、调节、粘附、移动、增生和分化中起重要作用。Bennett等［4］通过体外NET-1靶向shRNA的转导在人胃癌细胞建立体外NET-1基因敲除模型，结果显示转导的NET-1 shRNA的胃癌细胞导致NET-1 mRNA减少了97%(P＜0.000 1)，胃癌细胞的迁移减少了24%(P＜0.001)。这表明NET-1在胃癌侵袭机制中的重要作用。

FHIT基因属于组氨酸三联体(histindine triad，HIT)基因家族，其定位于染色体3p14.2，基因组全长约500 kb，由10个外显子组成，转录产物mRNA仅1.1 kb，编码一个由147个氨基酸残基组成的分子质量为16 800的FHIT蛋白。在人体包括心、肝、肺、肾和消化器官等组织中表达。其失活与许多上皮性恶性肿瘤的发生密切相关。FHIT基因在体内的具体功能尚未完全阐明。目前有研究者认为其参与细胞周期、细胞凋亡、信号传导等多环节的调控。Zheng等［5］通过对49例正常胃的黏膜层、49例腺瘤组织、84例癌旁组织、249例癌组织免疫组化微点阵检测FHIT和PTEN的表达，结果显示FHIT和PTEN在胃癌组织中表达低于正常胃的黏膜层、癌旁组织和腺瘤组织(P＜0.05)。FHIT和PTEN在胃癌组织中的表达显示与胃癌的浸润深度、淋巴管的侵袭、淋巴结转移、肝转移、胃癌分期呈负相关(P＜0.05)。下调FHIT和PTEN的表达会促进胃癌细胞凋亡和增殖的失调。总之，FHIT是很重要的抑癌基因，FHIT的表达缺失与胃腺癌的致癌作用、侵袭性、转移、预后等紧密相关。

Ki-67是一种存在于增殖细胞中的核抗原，其功能与染色质相连，与细胞有丝分裂有关，是目前应用最广泛的增殖细胞标记之一，表达范围覆盖除G0期以外的各增殖周期细胞，可用于判断恶性肿瘤预后。Zambon等［6］研究表明Ki-67通过启动近端启动子基因的表达促进细胞G0到G1期的转变，促进活体细胞三维空间的增殖。目前的研究已发现在多种实体恶性肿瘤中Ki-67的表达远高于正常组织，并与恶性肿瘤的发展、转移及预后有关。

本研究通过对胃腺癌组织中NET-1、FHIT、Ki-67蛋白表达及三者与患者生存预后的关系的观察发现:NET-1、Ki-67是在肿瘤细胞侵袭及增殖中发挥重要作用的蛋白分子，高表达NET-1、Ki-67能明显减少胃腺癌患者的术后生存时间;FHIT作为抑癌基因，其蛋白的高表达能明显延长胃腺癌患者的术后生存时间。

浸润和淋巴结转移是造成胃癌患者死亡的主要原因。癌细胞本身具有的多样性、异质性、时相性以及种类繁多的细胞外基质导致肿瘤转移的复杂性。通过对胃腺癌组织中NET-1、FHIT及Ki-67蛋白的表达情况与术后生存时间关系的研究，将有助于我们进一步深入了解肿瘤转移的分子机制，并可以为开辟肿瘤治疗的新途径，为临床制定有效合理的综合治疗方案提供可靠的理论依据。

［1］ Claerhout S，Lim JY，Choi W，et al.Gene expression signature analysis identifies vorinostat as a candidate therapy for gastric cancer［J］.PLoS One，2011，6(9):e24662.

［2］ 陈莉，李德春，朱远源.NET-1表达与肝癌临床病理因素相关性探讨［J］.中华肿瘤杂志，2007，27(4):248-250.

［3］ 江拥军，尹邦良.非小细胞肺癌组织中FHIT和HER2的表达及其临床意义的研究［J］.中华肿瘤防治杂志，2007，14(24):1875-1878.

［4］ Bennett G，Sadlier D，Doran PP，et al.A functional and transcriptomic analysis of NET-1 bioactivity in gastric cancer［J］.BMC Cancer，2011，11:50.

［5］ Zheng H，Takahashi H，Murai Y，et al.Low expression of FHIT and PTEN correlates with malignancy of gastric carcinomas:tissuearray findings［J］.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2007，15(4):432-440.

［6］ Zambon AC.Use of the Ki-67 promoter to label cell cycle entry in living cells［J］.Cytometry A，2010，77(6):564-570.