氟尿嘧啶缓释剂植入对人结直肠癌裸鼠移植瘤生长抑制的观察＊

李 弘，颜丽萍，石晓萍

（广西壮族自治区桂林市第二人民医院消化内科 541001）

氟尿嘧啶至今仍是结直肠癌化疗的首选用药，其对结直肠癌有着确切的抑制作用。新型植入用缓释氟尿嘧啶是长效缓释抗肿瘤制剂，用其治疗恶性实体肿瘤对肿瘤预后有相当大的改善，其优势在临床已有相关报道［1－3］。本研究旨在观察氟尿嘧啶缓释剂对裸鼠结直肠癌（colorectal cancer，CRC）移植瘤的抑制效果，以及验证其在抗结直肠癌方面的优势，以期能够进一步指导临床实践。

1 材料与方法

1.1 材料 BALB／c SPF级裸鼠32只，雌性15只，雄性17只，4周龄，体质量18～20g，购于桂林医学院动物实验中心，批号SCXK桂2007－0001；LoVo细胞系购于广西医科大学。

1.2 试剂 RPMI－1640培养基及胎牛血清（Hyclone公司）；兔抗人半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶－3（cysteinyl aspartate spe－clflc protease－3，caspase－3）多克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；5－氟尿嘧啶（5－FU）注射液（25mg／mL，上海旭东海普药业有限公司）；氟尿嘧啶缓释制剂（芜湖中人科技有限公司，批号20010826，每瓶100mg）。

1.3 方法

1.3.1 动物模型的建立 细胞复苏、培养、传代，于细胞对数期收集细胞，做成浓度为1.5×107的细胞悬液，裸鼠右前肢腋下注射0.2mL细胞悬液（细胞浓度为3.0×106个／只），10d左右肿瘤长至直径约5mm为致瘤成功，将其分为A组：磷酸盐缓冲液（PBS）尾静脉注射组8只；B组：5－FU尾静脉注射组8只；C组：5－FU瘤内注射组8只；D组：氟尿嘧啶缓释剂植入组8只。于致瘤成功后5、10、15d给予A组PBS 0.1mL、B组5－FU（100mg／kg）、C组瘤内5－FU（100mg／kg）相应处理，每次分3次给药，D组仅在成瘤后5d植入氟尿嘧啶缓释剂（100mg／kg）。药物干预15d后，处死裸鼠测定瘤体大小［测量肿瘤的最长径（a）和最短径（b），瘤体体积（V）＝0.5a×b2］、肿瘤质量。抑瘤率＝［1－实验组平均肿瘤质量（B、C、D组为实验组）／A组平均肿瘤质量×100%］，瘤体甲醛固定，石蜡包埋，常规HE染色后免疫组化检测caspase－3。

1.3.2 免疫组化及其结果判定

1.3.2.1 免疫组化法检测caspase－3蛋白的表达水平 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS（pH7.4）冲洗3次，每次3min；对组织抗原进行修复；每张切片加1滴或50μL 13%H2O2，室温下孵育10min，阻断内源性过氧化物酶。PBS冲洗3次，每次3min；除去PBS液，每张切片滴加1滴或30μL的caspase抗体（1∶100稀释在0.01mol／mL PBS中），室温下孵育30 min或4℃过夜，PBS冲洗3次，每次3min；除去PBS液，每张切片滴加1滴或30μL即用型MaxvisionTM快捷免疫组化试剂，室温下孵育10～15min，PBS冲洗3次，每次3min；除去PBS液，每张切片滴加2滴或100μL新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3～5min；自来水冲洗，苏木精复染，PBS或自来水冲洗反蓝，经过梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。37℃水浴箱孵育40min，PBS冲洗，干燥后镜检计数。

1.3.2.2 免疫组化结果判定 caspase－3蛋白阳性染色以细胞质呈黄色至棕黄色为主。在400倍镜下的染色最强区域中，每张组织切片选10个视野，使用目镜网格微尺计数1 000个细胞，阳性细胞率＝阳性细胞数／肿瘤细胞数×100%。

1.4 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件进行分析，数据用±s表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）、多个均数之间两两比较采用q检验。

2 结 果

2.1 移植瘤体生长情况、肿瘤质量及抑瘤率 32只动物均在10d左右成瘤，成瘤率100%。D组与A、B、C组30d后肿瘤体积比较差异均有统计学意义（P＜0.05，F＝27.01），D组与A、B、C组肿瘤质量比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；D组抑瘤率较A组明显升高，见表1。

表1 各组caspase－3的表达以及肿瘤质量及抑瘤率（±s）

表1 各组caspase－3的表达以及肿瘤质量及抑瘤率（±s）

▲：P＜0.05，与A组比较；＊：P＜0.05，与B组比较；＃：P＜0.05，与C组比较；－：表示此项无数据。

组别 caspase－3（%）瘤体体积（mm3）肿瘤质量（mg）抑瘤率（%）82.3 A 6.75±1.66 3 672±808 2.88±0.22 －B 21.13±3.67 2 421±467 2.31±0.21 19.8 C 48.50±6.62 1 663±692 1.36±0.25 52.8 D 72.88±4.51▲ 951±501＊ 0.51±0.11＃

2.2 HE染色结果 A组肿瘤细胞腺管形成、散在少量凋亡、有片状坏死；肿瘤组织侵袭到脂肪、肌层组织。B组肿瘤细胞异型性明显，恶性程度高，腺管状结构不明显，小区肿瘤细胞有小片凋亡，有小片出血坏死；肿瘤组织有局部侵袭到脂肪组织。C组肿瘤细胞异型性明显，腺管样结构不明显，小区肿瘤细胞片状凋亡，可见出血坏死灶；肿瘤边界清楚，未见明显侵袭。D组肿瘤细胞异型性不明显，腺管状结构不明显，小区肿瘤细胞凋亡明显，仅有少量坏死，肿瘤组织边界清晰，未见侵袭脂肪及肌层组织，生长缓慢（图1）。

2.3 caspase－3免疫组化结果 caspase－3的表达 A、B、C、D组是呈现逐渐上升的趋势（图2）。

图1 各组HE染色结果（×400）

图2 各组caspase－3的表达情况（×400）

3 讨 论

CRC是近年来发病率上升最快的消化道恶性肿瘤之一，其病死率也逐步上升［4］。CRC发病率在全世界位于肺癌、胃癌、乳腺癌之后居恶性肿瘤第4位，其病死率居第3位。在肿瘤的治疗方面，手术为主要方法，但放化疗对预后及防止复发十分重要。氟尿嘧啶一直是CRC的首选化疗药物，近年来发展的缓释给药系统使化疗药物能够持续稳定地释放，且维持有效的药物浓度，从而起到显著的杀灭肿瘤细胞的效果。氟尿嘧啶缓释剂较多用于外科手术中实体肿瘤切除后对肿瘤周边组织的化疗［5－7］，从而杀灭肿瘤的微转移灶，对肿瘤的复发及预后有相当大的改善。

本研究的HE染色及抑瘤率结果表明氟尿嘧啶缓释剂在对肿瘤的抑制方面比常规氟尿嘧啶制剂更有优势，其对肿瘤的抑制杀灭效果更好，这可能归功于缓释给药系统使药物能够达到较高的浓度，且作用持久［8］，将其用于结直肠癌术后的植入，对肿瘤微转移的杀灭有相当大的作用。特别是对于晚期或者不适合做手术的患者，植入缓释剂是个理想的选择。

caspase－3在细胞凋亡caspase级联反应中处于执行者的核心位置［9］，是细胞凋亡发生的关键步骤及一切凋亡信号传导的共同通路。caspase－3的表达不仅反映细胞的凋亡水平，而且反映凋亡启动因素的存在。本研究通过对荷瘤裸鼠采用不同的干预方式，发现用药组caspase－3的表达都有不同程度增高，提示氟尿嘧啶制剂能启动肿瘤细胞的凋亡程序，从而发挥抗瘤作用，这与张弦等［10］的研究一致。同时氟尿嘧啶缓释剂组表现出更高的caspase－3表达，这跟其能够达到更高的药物浓度是分不开的，提示其促凋亡作用呈现剂量相关性，这与符立平等［11］研究的结果在一定程度是一致的。

综上所述，氟尿嘧啶缓释剂能够更有效地诱导肿瘤细胞的凋亡而发挥抗肿瘤作用，进而抑制肿瘤的生长，且能减少肿瘤细胞异型性的发生，其在抗肿瘤方面呈现剂量相关性。氟尿嘧啶缓释剂植入后能够在局部达到较高的药物浓度，所以其抗肿瘤效果明显优于传统方式，且其作用持久，值得在临床作为结直肠癌的化疗药物推广。

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