黑根霉RN－M246催化雄甾－4－烯－3，17－二酮的11α－羟基化反应

胡 曦 予，崔 励，冯 魁

(大连工业大学 轻工与化学工程学院，辽宁 大连 116034)

0 引 言

甾体类药物是仅次于抗生素的第二大类药物，随着需求量的不断增大，合成甾体类药物的反应技术得到越来越广泛和深入的研究[1]。与传统化学合成方法相比，微生物转化反应污染低、能耗低、特异性高，且具有转化步骤简单、转化类型丰富等诸多优点[2]，因此人们逐渐将目光投向甾体微生物转化技术。

雄甾－4－烯－3，17－二酮是制造甾体激素类药物的关键中间体，在其甾体母核上引入羟基，可使其抗炎活性大大增强。经转化获得的11α－羟基雄甾－4－烯－3，17－二酮是制备用于治疗高血压及充血性心力衰竭的新型药物的关键中间体，临床疗效优于同类药物[3－4]。

目前，关于微生物法转化甾体药物的新菌种及新技术研究发展态势良好。国内外研究工作主要集中在甾醇制备雄甾－4－烯－3，17－二酮，以及运用赭曲霉及绿僵菌等菌种催化黄体酮，关于黑根霉催化合成11α－羟基雄甾－4－烯－3，17－二酮的内容鲜有报道[5－6]。

本文采用微生物转化法，以黑根霉RN－M246为实验菌种，雄甾－4－烯－3，17－二酮为底物，合成11α－羟基雄甾－4－烯－3，17－二酮，考察并优化11α－羟基化反应条件，提高产品转化率，为11α－羟基雄甾－4－烯－3，17－二酮的工业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

黑根霉RN－M246，清华大学生命科学院提供；雄甾－4－烯－3，17－二酮，11α－羟基 雄甾－4－烯－3，17－二酮，购自Sigma公司；其余各试剂均为分析纯，市售。

斜面培养基：小米培养基，pH自然。

发酵培养基(g／L)：葡萄糖30，蛋白胨20，冷榨豆粉10，柠檬酸三铵1，磷酸氢二钾5，pH 5.0。

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液的制备

黑根霉斜面中加适量无菌水，将孢子洗下，纱布过滤，充分振荡，制成107～108个／mL孢子悬液。

1.2.2 摇瓶转化工艺

在500mL摇瓶中加入50mL发酵培养基，接入4%的菌悬液，28℃、160r／min培养24h，其后加入10mmol／L的底物并提高转速至220r／min继续转化48h。

1.2.3 菌体干重的测定

抽滤发酵液，分离菌丝体及转化液，并将菌体用去离子水洗涤3次，放入80℃烘箱内烘干至恒重。

1.2.4 分析方法

将发酵液高速离心，取上清液用甲醇稀释，将稀释液用0.45μm有机滤膜过滤，作为检测样品，运用HPLC测定分析。色谱条件：C18烷基硅烷键合反相柱；流动相甲醇－水的体积比为3∶2；体积流量0.8mL／min；色谱柱温25℃；紫外检测器波长242nm。

2 结果与讨论

2.1 底物投料时间对产品转化率的影响

为确定底物投料的最佳时间，分别在反应开始以及菌体生长6、12、18、24、30、36h后投放10mmol／L的雄甾－4－烯－3，17－二酮，投放48h后考察其转化情况。

如图1所示，菌体发酵的前24h投料比其后投料效果好，并且在反应开始时投料转化率最高。分析其原因认为，虽然甾体对微生物具有毒性，但在底物添加量较少时，毒性抑制作用也很小。在菌体未成熟前，菌体不缠绕，较分散，此时添加少量底物，底物与菌体接触面积较大，更易充分接触，从而诱导更多利于底物进行11α－羟基化的酶生成，因此转化率高于菌体成熟后再添加底物。由此判断，反应开始时为添加底物的最佳时间。

图1 底物投料时间对转化率的影响Fig.1 Effect of feeding time on the conversion rate

2.2 发酵时间对产品转化率的影响

将底物与培养基一起灭菌后接种发酵，分别间隔12h检测转化率。通过不同的取样时间考察发酵过程，确定最佳的发酵时间。

如图2所示，发酵时间在12～48h，底物迅速转化，其后转化率增长缓慢，72h后转化率几乎不再提高，且可观察到菌体形态在72h后逐渐变得细碎。推测原因为发酵时间较长，培养基中菌体生长所需的营养物质变少，导致菌体不再生长甚至开始自溶，酶活力降低。因而发酵最佳时间为72h。

图2 发酵时间对转化率的影响Fig.2 Effect of fermentation time on the conversion rate

2.3 接种量对产品转化率的影响

接种量是决定菌体量、菌体形态及转化体系的重要因素之一。因而分别考察接入体积分数为2%、3%、4%、5%、6%、8%的菌悬液对转化率的影响。

由图3可知，接种量越大，菌丝体生长得越多，但接种量较多不利于转化。当接种量为4%时，转化率较高，因而选用4%为最佳接种量。

2.4 装液量对产品转化率的影响

黑根霉为好氧菌，且羟基化作用中的氧来自于空气[7]，适当的溶氧量不仅有利于菌体的生长，同时也促进羟基化反应的顺利进行，因而溶氧量是重要的考察因素。装液量在一定程度上与溶氧量相关，可通过装液量考察溶氧对发酵或生物转化的影响。本实验选用500mL摇瓶，分别考察装液量为25、50、75、100、125mL时对转化率的影响。

图3 接种量对转化率及菌体干重的影响Fig.3 Effect of inoculum concentration on the conversion rate and mycelium dry weight

溶氧量与菌体的生长发育、代谢途径以及产物形成密切相关。如图4所示，当装液量较低时转化率低，当装液量提高到75mL时，溶氧量较适宜，转化率最高可达47.5%，因而选用75mL为最佳装液量。

图4 装液量对转化率的影响Fig.4 Effect of volume of culture medium on the conversion rate

2.5 转化温度对产品转化率的影响

在生物转化过程中需要充足的菌体和酶，因而，菌体在28℃条件下生长24h后，在保证菌体量及酶的高活性的前提下，改变转化温度，考察转化过程最适宜的温度。由图5可见，在菌体生长较为成熟且转化仍迅速进行的24h时改变温度，发现温度小于28℃时转化率较低，转化率随着温度升高而升高，28℃时转化率达到最高，大于28℃后转化率略有下降。推测可能温度过高和过低对菌体生长或产相关酶不利，也可能使11α－羟基化酶活性降低。对于黑根霉催化雄甾－4－烯－3，17－二酮的11α－羟基化反应而言，28℃较适宜。

图5 转化温度对转化率的影响Fig.5 Effect of conversion temperature on the conversion rate

3 结 论

采用微生物转化法，以黑根霉RN－M246为实验菌种，雄甾－4－烯－3，17－二酮为底物，进行11α－羟基化反应合成11α－羟基雄甾－4－烯－3，17－二酮。通过工艺优化确定较优的工艺为每500mL摇瓶装入75mL发酵培养基，同时添加10mmol／L的底物，灭菌后超声，接入4%的菌悬液，在28℃发酵72h，转化率比优化前提高了约12%，最终转化率可达47.8%。

[1]郭一平，郑璞.甾体微生物C11α－羟化反应的研究进展[J].浙江工业大学学报，2004，32(4)：437－441.

[2]郭明，胡昌华.生物转化－从全细胞催化到代谢工程[J].中国生物工程杂质，2010，30(4)：110－115.

[3]杨英，姜绍通.微生物降解甾醇侧链转化雄甾－4－烯－3，17－二酮的研究进展[J].微生物学通报，2006，33(6)：142－145.

[4]DAVIS K L，NAPPI J M.The cardiovascular effects of eplerenone，a selective aldosterone－receptor antagonist[J].Clinical Therapeutics，2003，25(11)：2647－2668.

[5]叶丽，史济平.甾体微生物在制药工业中的应用[J].工业微生物，2001，31(4)：40－48.

[6]王普，陈希杨，虞炳钧，等.新技术在甾体药物微生物转化中的应用[J].化工进展，2002，21(11)：805－813.

[7]PETERSON J A，GRAHAM S E.A close family resemblance：the importance of structure in understanding cytochromes P450[J].Structure，1998，6(9)：1079－1085.