交联果胶酶聚集体的制备及其对罗布麻的脱胶效果

李 丰 硕，李 代，薛 永 常

(1.大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034；2.辽宁省大连海洋渔业集团公司，辽宁 大连 116113)

0 引 言

罗布麻有“野生纤维之王”之称，纤维含量极高，化学抗性好、延伸率低、结构紧密，有良好的医疗保健作用，日益在纺织行业得到高度关注。罗布麻纤维脱胶方法及脱胶深度直接影响其后续加工。传统的化学脱胶处理时间长，污染环境，消耗能源较大；生物脱胶具有脱胶周期短、纤维产量高、品质好和环境污染轻等特点[1]，薛卫巍等[2]筛选出一株高效罗布麻脱胶菌种，翟秋梅等[3]将该菌种用于罗布麻生物脱胶，效果明显。作者采用交联酶聚集体技术[4]对枯草芽孢杆菌FM208849所产的对罗布麻脱胶具有特异性作用的果胶酶进行固定化，在提高果胶酶在脱胶过程中的稳定性和高效性[5]的基础上，对果胶酶CLEAs的制备条件进行了初步研究，并对其在罗布麻皮的脱胶效果进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 实验材料

枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisFM208849，S－1)，本实验室分离保存。罗布麻(Apocynum venetumL.)，采自青海柴达木盆地。牛血清白蛋白，Roche产品；果胶，Sigma公司。

种子培养基[4]：牛肉膏3g／L，蛋白胨10g／L，NaCl 5g／L，pH 7.0，121℃灭菌20min。

发酵培养基[4]：果胶1g／L，葡萄糖3g／L，牛肉膏15g／L，NaCl 2g／L，121℃灭菌20min。

1.2 实验方法

1.2.1 交联果胶酶聚集体制备条件的确定

游离果胶酶的制取参考文献[6]，果胶酶活力测定采用DNS法[7]，蛋白含量测定采用Bradford法[8]，脱胶残胶率测定参考文献[9]，对交联果胶酶聚集体制备影响因素进行研究，通过测定果胶酶活力确定其交联条件。

1.2.2 交联果胶酶聚集体对罗布麻脱胶应用

将制备好的交联果胶酶聚集体用pH 9.5的Na2CO3－NaHCO3缓冲溶液配制成10mg／mL悬浮液，取不同的体积分别与制备好的沤麻液(含罗布麻皮1g)在45℃水浴中进行脱胶反应，脱胶10h后将残留的罗布麻皮用清水冲洗、烘干，测定其残胶率。在交联果胶酶聚集体的最佳脱胶时间的确定中，分别进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10h的脱胶反应，反应完成后测定罗布麻皮的残胶率。在考察交联果胶酶聚集体的操作稳定性时，每次脱胶完成后，将交联果胶酶聚集体离心、洗涤进行重复脱胶实验，共进行10次脱胶检测。

2 结果与分析

2.1 交联果胶酶聚集体交联条件确定

2.1.1 戊二醛体积分数

如图1所示，当戊二醛体积分数达到4%时相对酶活回收率达到最大值。戊二醛含有双功能基团，既是酶的交联剂，同时也是酶蛋白的变性剂，低浓度的戊二醛溶液易于果胶酶聚集体交联完全，而高浓度的戊二醛能使蛋白质变性。综合考虑，选择戊二醛溶液体积分数为4%。

图1 戊二醛体积分数对交联果胶酶聚集体酶活力的影响Fig.1 Effects of glutaradehyde concentrations on pectinase CLEAs activity

2.1.2 果胶酶聚集体交联温度

交联温度的改变对CLEAs活力回收率的影响如图2所示。当交联温度较低时，果胶酶CLEAs的活力回收率较高，30℃达到最大值；温度继续升高，CLEAs的活力损失较为严重，60℃时，CLEAs的活力回收率仅为15%左右，因此选择制备CLEAs交联温度为30℃。

图2 温度对交联果胶酶聚集体酶活力的影响Fig.2 Effect of cross－linked temperature on pectinase CLEAs activity

2.1.3 果胶酶聚集体交联时间

将2mL的4%的戊二醛溶液缓慢滴加到制备好的果胶酶聚集体的悬浮液中，定时取样，计算果胶酶CLEAs的活力回收率。图3所示果胶酶CLEAs的酶活回收率随着交联时间的逐渐延长而增大，当交联时间为135min时，CLEAs的酶活回收率最大，达到61.5%，随着时间的继续增加，酶活回收率开始慢慢下降，因而确定交联果胶酶聚集体的最佳交联时间为135min。

图3 交联时间对果胶酶聚集体酶活力的影响Fig.3 Effects of crosslinking time on pectinase CLEAs activity

2.2 交联果胶酶聚集体对罗布麻的脱胶效果

2.2.1 罗布麻脱胶的交联果胶酶聚集体体积质量的确定

20mL沤麻液(含罗布麻皮1g)与不同体积的10mg／mL交联果胶酶聚集体进行脱胶反应，脱胶效果如图4所示。随着交联果胶酶聚集体含量的增加，罗布麻皮的残胶率显著下降，当CLEAs体积质量达到2.5mg／mL时，罗布麻皮的残胶率降至最低仅为4.55%，而当CLEAs的用量大于2.5mg／mL时，罗布麻的残胶率不再有明显下降。因而1g罗布麻皮脱胶所需的交联果胶酶聚集体为50mg，残胶率为4.55%。

图4 交联果胶酶聚集体的体积质量对罗布麻脱胶效果的影响Fig.4 Effect of CLEAs content on apocynum degumming

2.2.2 交联果胶酶聚集体的最佳脱胶时间

50mg交联果胶酶聚集体与20mL沤麻液在45℃条件下进行脱胶反应，不同脱胶时间的罗布麻皮中残胶率的结果如图5所示。在脱胶反应进行8h后，罗布麻皮中的残胶率趋于平衡，不再降低，因此，交联果胶酶聚集体与沤麻液在45℃下进行脱胶反应的最佳时间为8h，罗布麻皮的残胶率可降至4.61%。

图5 脱胶时间对罗布麻脱胶效果的影响Fig.5 Effect of degumming time for apocynum degumming

2.2.3 交联果胶酶聚集体脱胶的操作稳定性

对50mg的交联酶聚集体与20mL沤麻液(含罗布麻皮1g)在45℃下进行共10次重复脱胶反应，结果如表1。在经过10次的罗布麻脱胶实验后，还能保证罗布麻的残胶率在11.25%以下，说明交联果胶酶聚集体的操作稳定性较好。

表1 交联果胶酶聚集体操作稳定性Tab.1 Operation stability of CLEAs

3 结 论

以体积分数为4%的戊二醛作为交联剂，30℃水浴中交联135min得到的交联果胶酶聚集体果胶酶活性最高。利用5mL的10mg／mL的交联果胶酶聚集体对罗布麻皮脱胶8h，可将其残胶率降至4.61%。将果胶酶CLEAs进行10次罗布麻皮脱胶实验后，残胶率降至11.25%，说明其可重复利用率较高。

[1]鲍明东，陈卓，刘自镕，等.罗布麻生物脱胶研究初报[J].山东农业科学，2002(6)：11－13.

[2]薛卫巍，薛永常，翟秋梅，等.适于罗布麻生物脱胶的果胶酶产生菌分离筛选与表征[J].工业微生物，2009，39(2)：55－58.

[3]翟秋梅，薛永常，薛卫巍，等.罗布麻酶法脱胶初探[J].食品与生物技术学报，2011，30(1)：118－123.

[4]CAO L，van RANTWIJK F，SHELDON R A.Cross－linked enzyme aggregates：A simple and effective method for the immobilization of penicillin acylase[J].Organic Letters，2000，2(10)：1361－1364.

[5]翟秋梅，薛卫巍，薛永常，等.枯草芽孢杆菌FM208849产果胶酶发酵条件的优化[J].大连工业大学学报，2010，29(2)：93－97.(ZHAI Qiu－mei，XUE Wei－wei，XUE Yong－chang，et al.The optimization of pectinase fermentation fromBacillussubtilisFM208849[J].Journal of Dalian Polytechnic University，2010，29(2)：93－97.)

[6]李丰硕，张灿，薛永常，等.枯草芽孢杆菌FM208849产果胶酶的固定化及酶学性质研究[J].生物技术通报，2012(6)：141－146.

[7]张飞，岳田利，费坚，等.果胶酶活力的测定方法研究[J].西北农业学报，2004，13(4)：134－137.

[8]袁道强，黄建华.生物化学实验和技术[M].北京：中国轻工业出版社，2005：184－188.

[9]薛卫巍，翟秋梅，薛永常，等.罗布麻微生物脱胶工艺优化[J].纺织学报，2009，30(4)：80－84.