保加利亚乳杆菌的增菌培养基设计及生长动力学研究

戴 远 臣，侯 红 漫，张 公 亮

(大连工业大学 食品学院，辽宁 大连 116034)

0 引 言

发酵动力学是研究微生物生长活动中菌体的生长、底物的消耗、产物形成与各种环境因素相互的作用及内在规律的科学[1]。近年来，人们开发了多种数学工具软件，这些软件在发酵动力学模型分析中得到了很好的应用。尤其是MATLAB软件，虽然已经在科学界推广，但它在微生物生长预测模型中的应用仍处于摸索阶段[2]。目前，尚未见将山楂多糖[3]作为促生因子对保加利亚乳杆菌增殖作用分析的研究报告。作者对保加利亚乳杆菌的增殖培养基进行优化设计，以提高乳酸菌的比生长速率和菌体浓度，同时应用MATLAB软件对Logistic方程[4]进行最优参数估计和非线性拟合，建立了较为合理的菌体生长动力学模型，以期为分批发酵提供理论基础。

1 实 验

1.1 菌种与原料

保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus，6047)，由大连工业大学微生物实验室提供。

山楂多糖采用水提醇沉法制得。山楂加水打浆，90℃热水浴提取6h，0.1%果胶酶3h后灭酶10min，离心抽滤后进行浓缩，95%乙醇醇沉、离心，复溶于水中后再次醇沉、离心，最后用无水乙醇反复洗涤，于50℃烘箱干燥制得山楂多糖。测得山楂多糖质量分数为472.2mg／g，经实验证明对保加利亚乳杆菌有促生作用。

脱脂奶粉：市售伊利脱脂乳粉。

MRS培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，蒸馏1 000mL，pH 6.2～6.6，121℃灭菌10min。

1.2 实验方法及动力学模型

1.2.1 测定方法

总糖采用苯酚－硫酸法测定[5]。

菌悬液吸光值(OD600nm)：用UV2102型紫外可见分光光度计在600nm条件下比色，测定菌悬液的吸光值，以接种3%保加利亚乳杆菌的液体培养基为空白对照。细胞浓度以OD600nm表示。

1.2.2 实验方法

菌种的活化：将保加利亚乳杆菌以3%的接菌量接种于12%的液体脱脂乳中，37℃培养8h，待凝乳后再传代2次后接种培养。

山楂多糖浓度对保加利亚乳杆菌生长的影响：将保加利亚乳杆菌以3%接种量分别接入0、1%、2%、3%山楂多糖的 MRS培养基中，每组3个平行。于42℃培养12h，在600nm下测定OD值，研究对保加利亚乳杆菌生长的影响。

pH和温度对保加利亚乳杆菌生长的影响：得到山楂多糖最适添加量后，制备不同初始pH(6.0、6.5、7.0)的含有2%山楂多糖的液体 MRS培养基，每组3个平行。将保加利亚乳杆菌以3%接种量分别接入上述试管当中，将3组试管分别在32、37、42℃下培养12h，测 OD600nm(表1)。

表1 不同温度、pH试管编号表Tab.1 Number of test tube in different pH and temperature

发酵动力学实验：培养基为山楂多糖优化MRS培养基。装液量为500mL三角瓶300mL，每个重复3次，发酵周期24h，每2h测定OD600nm，取3次测定结果的平均值。

1.2.3 菌体生长动力学模型

为了更好地对发酵中菌体的生长动力学进行描述，实验采用Logistic模型能较好地拟合分批发酵过程中菌体生长过程：

t＝0时X＝X0，该方程式的积分式为

式中：X为菌体浓度；dX／dt为菌体生成速率；X0为t＝0时菌体的初始浓度；Xmax为菌体的最大浓度；μmax为最大比生长速率，h－1；t为培养时间，h。

2 结果与讨论

2.1 山楂多糖对保加利亚乳杆菌生长的影响

如图1所示，山楂多糖添加量在0～2%，保加利亚乳杆菌OD值随山楂多糖浓度的增加而上升；多糖浓度继续升高，菌体OD值反而下降，结果表明，并非山楂多糖浓度越高，保加利亚乳杆菌生长最旺盛，原因可能是山楂多糖浓度过高促使培养液渗透压增大影响其正常的生长。故2%为山楂多糖的最适添加量。

图1 不同山楂多糖添加量对保加利亚乳杆菌生长的影响Fig.1 Effect of different hawthorn polysaccharide concentration on the growth of Lactobacillus bulgaricus

2.2 pH和温度对保加利亚乳杆菌生长的影响

如图2所示，处于32℃的不同pH环境下保加利亚乳杆菌生长均较缓慢，处于37℃的保加利亚乳杆菌在pH为6.5生长比较旺盛。处于42℃、pH为6.5的保加利亚乳杆菌菌体生长最为旺盛，故最适pH为6.5，最适温度为42℃。

2.3 优化山楂多糖培养基对保加利亚乳杆菌增殖效果的比较

图2 在不同pH和温度条件下，山楂多糖(w＝2%)对保加利亚乳杆菌生长的影响Fig.2 Effect of hawthorn polysaccharide(w＝2%)on the growth of Lactobacillus bulgaricus at different pH and temperatures

图3 保加利亚乳杆菌在优化增殖培养基、MRS培养基中的生长曲线Fig.3 The growth curve of Lactobacillus bulgaricus in optimized multiplication medium and in MRS medium

菌种活化后，以3%接种量分别接种到优化后的含有山楂多糖MRS液体培养基(pH＝6.5)、MRS培养基中，在42℃恒温培养，测定生长曲线，同时做平行试验。结果见图3。通过保加利亚乳杆菌在不同培养基中的生长曲线可以发现，与正常MRS培养基相比，保加利亚乳杆菌生长的对数期提前，并且稳定期最大吸光度值达到了0.671，从14h开始进入衰退期，而且稳定期相对较长，比正常MRS培养基中生长效果明显。在优化培养条件下添加2%山楂多糖可有效促进保加利亚乳杆菌生长，并且培养10h后的最大菌体浓度是正常MRS培养基菌体浓度的1.13倍。

2.4 模型参数的求解

应用MATLAB软件对实验数据进行非线性规划，采用最小二乘法，建立误差平方和最小为目标，获得待估参数。根据实验数据和经验得到模型参数的初估值，经麦夸特算法逐步迭代进行数据拟合，不断修正模型参数的初估值，直到获得全局性收敛的最优参数估计值，其估计值为μmax＝0.573，Xmax＝1.565。

2.5 模型的验证

为了验证模型的可靠性，根据所建立的菌体生长动力学模型可得到分批发酵过程中菌体浓度随发酵时间变化的拟合值，进而计算出实测值与拟合值之间的相对误差，结果如表2所示。从误差的分布来看，除发酵的初期误差值达到8.8%外，其他拟合值与实验值的误差相对较小，模型对发酵后期菌体生长的模拟效果相对较好。说明所创建数学模型能较好地反映保加利亚乳杆菌在优化的培养基中菌体生长动力学特征。

表2 模型拟合值与实验值的比较Tab.2 Comparison of experimental value and fitted value of models

3 结 论

保加利亚乳杆菌在2%的山楂多糖、pH为6.5、温度为42℃条件下生长最为旺盛。在优化后的山楂多糖培养基中最大菌体浓度是正常MRS培养基中菌体浓度的1.13倍。

得到保加利亚乳杆菌在优化培养基中分批培养的生长动力学方程为dX／dt＝0.573(1－X／1.565)X，拟合值和实验值相对误差在10%范围内，能较好地反映保加利亚乳杆菌在优化的培养基中菌体生长动力学特征。

[1]韩润林，陈洪章，李佐虎.枯草杆菌溶栓酶恒溶氧发酵动力学参数估计[J].过程工程学报，2002，2(1)：55－57.

[2]张宇婷，孟雅娟，闫国婷，等.Matlab在微生物生长预测模型中的应用[J].河北化工，2008(1)：20－22.

[3]李艳红，林勤保，罗莹.山楂多糖的提取研究[J].农产品加工，2006(5)：43－46.

[4]ROBINSON D K，WANG D I C.A transport controlled bioreactor for the simultaneous production and concentration of xanthan gum[J].Biotechnology Progress，1988，4(4)：231－241.

[5]谭玉玲.中药红芪药材鉴定及多糖提取工艺研究[D].兰州：兰州理工大学，2010：8.