青头菌的分离纯化及ITS序列鉴定*

马红英，杨明挚，张汉波，乔云倩，沙 涛＊＊

(1.云南大学生物资源保护与利用国家重点实验室培育基地，云南 昆明 650091;2.云南大学生命科学学院，云南 昆明 650091)

青头菌又名绿菇 (Russula virescens)，隶属于红菇科(Russulacese)、红菇属 (Russula)，子实体大，食味鲜美，营养丰富，是常见菌类中最受人们欢迎的食用菌之一［1］。青头菌是外生菌根真菌，与阔叶树种及针叶树种如云南松等形成外生菌根［2］。青头菌中各种矿物元素和人体必需氨基酸的含量为0.58%，氨基酸总量为1.39%，必需氨基酸占总氨基酸的比值 (EAA/TAA)为41.8%，硒为每100克1.3 mg［3］。青头菌子实体中所含的4种多糖为杂多塘，含有的单糖组分分别为木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖以及果糖，其中葡萄糖为主要单糖组分［4］。Zhong－wei Sun等报道青头菌中含有可溶性粗多糖命名为RVP－1和RVP－2，其中RPV－1为较好的抗氧化剂［5］。

目前，青头菌的研究报道不多，国内主要集中在保鲜和化学成分分析方面。赵天瑞等［6］对青头菌冻结工艺进行了研究，汤建国等报道变绿红菇化学成分研究分析结果［7］，孙忠伟等报道变绿红菇子实体多糖的理化性质及其抗肿瘤活性研究［4］，徐丹先等报道云南野生青头菌的化学成分分析结果［3］。国外对青头菌的报道主要集中于系统发育方面，澳大利亚Lebel和Tonkin报道经ITS鉴定的红菇科系统发育结果［8］。欧洲Miller和Buyck对红菇属以下的种进行了分子系统发育分析，报道青头菌与Russula mustelina亲缘关系较近［9］。Shimon等通过对rDNA大亚基鉴定，红菇科系统发育分析结果显示，青头菌与红菇属Russula viridirubrobimbata亲缘关系较近［10］。目前，人工驯化方面还未取得实质性进展，虽有报道青头菌的菌丝体分离研究，但未见对其得到的菌丝体进行鉴定。

对于食用菌的人工驯化，首先需要解决食用菌的菌种分离问题。食用菌菌种分离方法主要有孢子分离法、组织分离法和基内菌丝分离法3种。其中组织分离法无菌操作技术要求较其他方法简便，因此组织分离法在实践中被广泛地应用［11］。分离菌丝体的鉴定是后续研究的基础，其中ITS(Internal Transcribed Spacer)是核糖体DNA中的非编码转录间隔区，目前被广泛应用于不同物种的系统发育、进化和分类研究及菌种鉴定［12］，是真菌条形码之一，在外生菌根真菌分离物的鉴定中也得到广泛运用。

本研究采用组织分离法对菌柄及菌盖进行分离，对ITS序列进行鉴定。

1 材料及方法

1.1 供试菌种

青头菌子实体，采于弥勒县，编号为ML4。

1.2 培养基

PDA培养基;MMN改良培养基:马铃薯200 g(去皮，切片，煮沸20 min，用4层纱布过滤，取滤液)、葡萄糖5 g、麦芽糖2 g、酵母粉1 g、酒石酸铵0.25 g、KH2PO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.15 g、氯化钙 (1%)5 mL、氯化钠 (1%)2.5 mL、氯化铁 (1%)1.2 mL、琼脂16 g，pH 5.5，蒸馏水1 000 mL;改良培养基:KH2PO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、麦芽糖5 g、酒石酸铵2 g、VB11 mL(40 μg·L－1)、琼脂粉20 g，pH 6.0，水 1 000 mL。

3 方法

3.1 菌丝体的分离、纯化

采用组织分离法，将预先配好的以上3培养基切成大小2 cm×2 cm的小块，分装于各平板中，每平板5块，尽量留足够的间隙。之后于无菌条件下用镊子取已经用酒消毒的新鲜子实体菌柄、菌盖部位的组织，置于母种培养基上，25℃恒温培养。每处理5次重复，一级母种满管后转管2次。观察菌丝的生长速度及菌落形成情况。

3.2 DNA的提取、扩增及鉴定

采用CTAB真菌DNA提取法［13］，将挑取的菌丝置于经灭菌的1.5 mL干燥离心管，加入400 mL CTAB提取液，进行研磨，研磨充分后加入200 mL CTAB提取液，65℃水浴1 h，再加入600 mL氯仿－三氯甲烷混合液，混合均匀后13 000 r·min－1离心10 min，收集上清液于新的1.5 mL离心管，之后重复以上操作2遍～3遍，直至上清液干净。之后用等体积的三氯甲烷抽提，然后在抽提所得的上清液中加入0.5倍～1倍体积的异丙醇，4℃、13 000 r·min－1离心10 min。离心完毕后，弃上清液，将离心管倒扣于干净的滤纸上直至吸光管上液体，之后用75%乙醇洗涤并离心2遍，倒扣于滤纸一夜，第2天加入40 μL去离子水。

采用通用引物 ITS4和 ITS5(ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC;ITS5:GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)， 对 其ITS rRNA基因进行扩增［12］。扩增体系总体积为50 μL，其中41.35 μL 去离子水，10 × PCR Buffer 5 μL，10 mmol·L－1dNTP 1 μL，10 μmol·L－1ITS4/ITS5 引物各0.6 μL，TaqDNA 酶0.25 μL，模板 DNA 1 μL(浓度 20 ng·μL－1～50 ng·μL－1)。PCR反应条件:94℃反应1 min，94℃反应15 s，61℃反应15 s，72℃反应1 min，30个循环，72℃反应5 min。

测序反应体系为:kit酶 2 μL，0.5 μmol·L－1ITS4/ITS5引物3 μL，PCR反应产物1 μL。测序反应条件为96℃反应10 s，50℃反应5 s，60℃反应4 min，25个循环。

测序结果通过DNAStar、Chromas软件校对，并在NCBI中BLAST比对下载已发表的＞96%的相似序列，相关序列用MEGA 4软件经CLUSTALW比对，剪切136 bp～834 bp位点序列，采用Jukes－Cantor模型构建N－J树。

2 结果

2.1 分菌统计结果

分别对5块菌盖及菌柄进行分离，结果见表1。

表1 各培养基及各分离部位分离统计

从表1可以看出，PDA培养基分离成功数均为0，MMN改良培养基成功数为菌盖成功数3，菌柄成功数4，改良培养基成功数分别为菌盖成功数3，菌柄成功数4，因此MMN改良培养基为最佳培养基。

2.2 形态观察结果

分离物在25℃下培养50 d，形态观察结果见图1。

从图1可以看出，菌落呈乳白色，圆形，菌丝致密，气生菌丝不发达。

3 系统发育树结果

系统发育树结果见图2。

从图2可以看出，青头菌的多样性较丰富，种内差异较大。而本研究所分离的菌株ML4不与其他序列形成1支，遗传差异较大。

4 讨论

由于青头菌是营养共生型的外生菌根菌，必须供给其合适的营养成分和生长条件才能使其孢子萌发、菌丝生长。在培养中菌丝生长较慢且极易被污染，因此在分离过程中要严格地进行消毒和无菌操作。本研究发现作为真菌分离常用的培养基PDA不能作为青头菌分离的培养基，选用改良MMN培养基，对菌柄进行分离为最佳分离方案，分离成功率达到80%，因此改良MMN培养基为菌种分离最佳培养基。本实验研究中由于青头菌菌种菌丝生长较慢，生长2个月达到5 cm左右便停止生长，因此要达到人工驯化的目的，还需进行进一步的优化培养研究，寻找营养足够适合该菌种生长的培养基。

外生菌根分离物是食用菌人工驯化的基础，因此必须对菌种进行科学鉴定。目前菌种鉴定，遗传多样性研究主要基于形态学水平、细胞水平、生化水平及分子水平得以开展［14］。而DNA作为遗传物质能客观和真实地反映物种之间的亲缘关系，对于菌种鉴定和系统分类是一种更有力的依据和补充。对比分离物及对应子实体DNA指纹并结合分离菌株的形态特征来鉴别菌株是否属于目的菌种的方法更趋科学和完善。因此，建议以后的研究利用分子方法对分离物进行鉴定。

本研究还发现，本实验所分离到菌种与其它地区的青头菌有较大的遗传差异性，而且青头菌的种内差异较大，生物多样性较为丰富，而云南野生食用菌资源较为丰富，青头菌分布较为广泛。因此，下一步进行云南野生青头菌的系统发育研究是必要的。

［1］黄萍，沈孝善.绿菇子实体菌株的原生质体分离及再生菌株的获得 ［J］.西南农业学报，2001，14(1):91－94.

［2］朱启顺，杨大智.绿菇与云南松共生关系的研究［J］.中国食用菌，1999，18(5):19－20.

［3］徐丹先，林佶，段志敏，等.云南野生青头菌的化学成分分析［J］.现代预防医学，2012，9(9):5541－5542.

［4］孙忠伟，张丽香，王愈，等.变绿红菇子实体多糖的理化性质及其抗肿瘤活性［J］.农产品加工学刊，2009(7):77－81.

［5］ Sun ZW，Zhang LX，Zhang B，et al.Structural characterisation and antioxidant properties of polysaccharides from the fruiting bodies of Russula virescens［J］.Food Chemistry，2010(118):675－680.

［6］赵天瑞，樊建，覃宇悦，等.青头菌冻结工艺研究［J］.中国食用菌，2007，26(4):50－52.

［7］汤建国，邵红军，刘吉开.变绿红菇化学成分研究 ［J］.中草药，2008，39(12):1776－1778.

［8］ Lebel T，Tonkin JE.TonkinAustralasian species of Macowanites are sequestrate species of Russula(Russulaceae，Basidiomycota) ［J］.Australian Systematic Botany，2007(20):355－381.

［9］ Miller TL，Buyck B.Molecular phylogeny of the genus Russulain Europe with a comparison of modern infrageneric classifications ［J］.The British Mycological Society，2002，106(3):259－276.

［10］ Shimono Y，Kato M，Takamatsu S.Molecular phylogeny of Russulaceae(Basidiomycetes，Russulales)inferred from the nucleotide sequences of nuclear large subunit Rdna ［J］.Mycoscience，2004(45):303－316.

［11］任桂梅，赵海鹰，邓振山，等.菌种分离技术及其降低污染率与死亡率实验教改初探［J］.延安大学学报:自然科学版，2007，26(4):65－67.

［12］沙涛，丁骅孙，张汉波，等.利用松茸ITS特异性引物对松茸分离物进行鉴定 ［J］.云南植物研究，2004，26(5):524－528.

［13］ Zolan ME，Pukkila PJ.Inheritance of DNA methylation in Coprinus cinereus［J］.Molecular and Cellular Biology，1986，6(1):195－200.

［14］张靠稳，杨振华，马爱瑛.标记技术在食用菌遗传多样性中的研究进展［J］.贵州农业科学，2010，38(6):6－9.