手工制备冰冻解冻红细胞方法与操作要点

王惟 李丹 刘微

随着成分输血的开展，冰冻解冻去甘油红细胞是用甘油作为冷冻剂低温冰冻保存红细胞制剂的一种方法，是在紧急情况下，能够及时抢救Rh阴性的患者，近年来临床应用受到重视，它是一种低温保存红细胞很有效的方法［1］。早在60年代，就已建立了冰冻红细胞低温保存技术，因为温度较低的状态下，红细胞代谢会逐渐降低，或者细胞代谢活动停止。这样红细胞能量的消耗也降低，红细胞的一些代谢产物也会随之降低，使红细胞处在休眠状态。冷冻血是其它制剂所不能替代的制剂，长达十年的保存期［2］。使Rh阴性血的来源得到保障。为患者抢救争取了保贵时间。目前红细胞冷冻保护剂应用的是复方甘油溶液。由于甘油渗透压较高，人体输入过量甘油会造成细胞溶血，给患者造成极大损害。所以为了更好提高冰冻解冻去甘油红细胞的质量，作者在制备时采用手洗梯度洗涤法来制备，在红细胞制备、保存、解冻洗涤过程中积累一些经验，现和大家分享一下。

1 材料与方法

1.1 试剂与耗材 57%复方甘油溶液、9%氯化钠溶液、三珠冷冻袋、无菌四联袋(北京博德桑特输采血器材科技开发中心)、羟乙基淀粉溶液(济南三九益民制药公司)、0.9%生理盐水(吉林康乃尔公司)、振荡器(HY-4金坛市)、无菌接驳机(SC-203A泰尔)、恒温水浴箱(余姚市东方电工仪器厂)、-80℃速冻冰箱(三洋)、离心机(贺利氏6000I)。

1.2 冰冻红细胞制备方法 加入甘油，将保存期6d内的全血或红细胞悬液离心，2200 r/min，25 min，去除上清后，将红细胞用无菌接驳机与三珠袋相接，并转移至三珠袋中加甘油，动作一定要轻柔，避免对红细胞造成人为损伤。200 ml红细胞需加甘油160 ml，加甘油滴速必须控制，先慢后快，前5 min甘油滴速为40滴/min左右，5 min后甘油滴速可以控制为80滴/min，20 min滴加完毕。振荡器的频率为60次/min，振幅为5 cm。甘油化的红细胞尽量减少人为移动，需要在室温静止30 min，30 min后送-80℃速冻冰箱速冻待用，保存一个月以上方可应用。

1.3 洗脱甘油 取出保存在-80℃速冻冰箱内的冰冻红细胞，在37～42℃水浴箱内融化，融化时间为每袋4～5 min，水浴箱内的水要没过血袋，融化完成，取出在室温下静止5 min，用无菌接驳机连接空袋，在4℃条件下，2300r/min离心8min后去除上清，然后用无菌接驳机与输血器下端连接，输血器上端连接9%NaCl溶液(80 ml)，滴速先慢后快，前2 min滴速为20～30滴，2 min后滴速调至50～60滴/min，7 min加完。静止5 min后，加入羟乙基淀粉溶液100 ml，滴速控制在40～50滴/min，静止5 min后，再加入0.9%氯化钠溶液50 ml后，开始离心，2300转8 min去除上清后，加入0.9%氯化钠溶液150 ml，匀速加入，60～80滴/min。以上在往冰冻红细胞加入溶液时均需在振荡下完成，振荡器的频率为60次/min，振幅为5 cm。连续洗涤三次，制备成冰冻解冻去甘油红细胞。

1.4 在制备过程中加甘油后不同放置时间和洗脱时不同离心力对产品质量有较大影响，按照这两项条件不同将制备的产品分A组和B组。

1.5 质量控制标准 上清血红蛋白不超过1 g/L;残余甘油含量在10 g/L;红细胞回收率 ＞80%;体外溶血实验≤50%［3］。

2 结果

2.1 甘油化时红细胞加甘油后不同放置时间，A组15 min，B组30 min，检测甘油残留量，A组甘油残留量:7.85±0.65(g/L);B组甘油残留量:(4.49±0.92)(g/L)。每组各8袋。两组相比P＜0.05，差异有统计学意义。

2.2 在洗脱甘油过程中，适当的离心力既能很好地去除甘油，又能减少重离心对红细胞的破坏，作者采用不同离心力制备冰冻红细胞后检测冰冻红细胞各项参数，做如下比较，A组2600转/min，B组3300转/min，见表1。

表1 洗脱甘油过程中两种离心力的对比

3 讨论

冰冻解冻去甘油红细胞主要用于Rh阴性血的长期保存，以及为自身输血创造条件［4］。能极大缓解供需紧张的矛盾。自从本站开展冰冻解冻去甘油红细胞技术以来，为临床患者提供很大方便。但是在手工制备过程中，一些微小的细节应该引起制备者的注意。①滴速问题，先慢后快的滴速对红细胞膜的刺激作用会变小一些，让红细胞膜内外的环境在逐渐变化，以免因为渗透压作用造成对红细胞膜的损害。②加入甘油后的成品，三珠袋内的空气一定要排净，因为血袋内微小的空气气泡聚集在一起形成大气泡，会破坏红细胞膜，极易造成溶血。③在-80℃速冻冰箱取出的冰冻红细胞，尽量减少在室温的放置时间，在加入甘油后要保证静止时间。④离心问题，经过多次选择离心力，试验证明，离心力大小很影响冰冻红细胞的质量，过大离心力会对红细胞造成不可逆转的损伤。对于加入甘油冰冻保存长达十年红细胞来说，保护红细胞膜十分重要。⑤振荡器的振幅和频率也很重要，必须保持在有效范围内，振幅5 cm，频率60次/min。⑥临床应用冰冻解冻去甘油红细胞经过去甘油的反复洗涤，去除了细胞代谢产物，以及大部分的白细胞、血小板、血浆蛋白，能大大减少输血反应。能为临床患者提供高质量的冷冻血。

［1］ 邱艳．全血成分血质量要求与血液标准化．北京:中国标准出版社，2002:72-73．

［2］ 王培华．输血技术学．北京:人民卫生出版社，2002:70-73．

［3］ 中华人民共和国国家标准．全血及成分血质量要求GB18469-2001．

［4］ 安万新，于卫建．输血技术学．北京:科学技术文献出版社，2010:167．