海南地区APM-1基因多态性与脑梗死患者血清脂联素水平的相关性

何 平 丁毅鹏 陈晓玲 (海南省人民医院急救中心，海南 海口 570311)

在缺血性脑卒中类型中动脉粥样硬化性脑梗死(ACI)则较为常见〔1，2〕。研究证实在脑卒中的发病过程中遗传因素起着重要的作用，因而寻找其易感基因则是目前国内外学者的研究热点〔3〕。脂联素是一种脂肪因子，通过与脂联素受体结合后有着抗炎、抗动脉粥样硬化及提高胰岛素敏感性等作用。本研究探讨海南地区汉族人群中ACI的脂联素APM-1基因多态性与血清脂联素水平、血脂血压的关系，进一步认识ACI的分子遗传机制。

1 资料与方法

1.1 入选标准 ACI诊断以全国第四届脑血管疾病会议修订的脑梗死诊断标准，收集到ACI患者120例(男78例，女42例)，平均年龄为(58.43±10.86)岁，平均体重指数(BMI)为(26.28±2.59)kg/m2，120例正常对照者(男60例，女60例)，年龄范围(57.96±9.52)岁，平均 BMI(23.10±2.14)kg/m2。其中 ACI组患者有高血压史者为89人，占组内总人数74.17%;有糖尿病史者为31人，占组内总人数25.83%。而对照组中有高血压史者为18人，占组内总人数15%;有糖尿病史者为4人，占组内总人数3.33%。健康体检者为对照组120例，无血缘关系，同时排除有冠心病、心脑血管疾病家族史、肝肾疾病、自身免疫性疾病、血液病、妊娠、半年内有过降脂治疗者。ACI组:住院病人120例，同样也无任何血缘关系。符合全国第四届脑血管疾病会议修订的脑梗死诊断标准，并经头颅CT或(和)MRI确诊。排除其他疾病引起的脑梗死。

1.2 DNA制备 受试者常规禁食12 h后，于次日7:00～8:00采静脉血5 ml，采用构椽酸钠抗凝，利用常规酚/氯仿抽提法提取DNA。

1.3 引物设计 引物采用PrimerPremier5.0软件设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，测序由上海申能博彩生物技术有限公司完成。PCR引物序列为5'-CTGAGATGGACGGAGTCCTTT-3'，5'-CCAAATCACTTCAGGTTGCTT-3'，片段长度为456 bp。

1.4 基因测序 采用PCR-RFLP结合测序技术进行基因型分析。所有酶切产物以2%琼脂糖凝胶电泳分析，电泳后应用GIS凝胶图像处理系统观察结果。

1.5 血清脂联素水平测定 采用双抗夹心酶联免疫吸附试验，上海美季生物技术有限公司提供试剂盒，按说明书操作。

1.6 统计学分析 应用SPSS13.0软件，采用HWE软件检验基因型的Hardy-Weinberg平衡吻合度，以基因计数法计算ACI组和对照组基因型和等位基因频率。计数资料比较采用χ2检验。计量资料比较采用t检验，两组以上比较采用方差分析。

2 结果

2.1 SNP45T/G及SNP276G/T的测序情况 见图1，图2。

图1 SNP45T/G测序情况

图2 SNP276G/T测序情况

2.2 ACI患者各血脂指标及脂联素水平的比较 ACI组中的总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)血清水平与对照组相比较，均有显著的升高(P＜0.001)，ACI组中的高密度脂蛋白(HDL)及脂联素各自的血清水平与对照组相比较，有明显的降低，P ＜0.001。见表1。

表1 血脂及脂联素血清学检测比较(n=120，±s)

表1 血脂及脂联素血清学检测比较(n=120，±s)

组别TC(mmol/L)HDL(mmol/L)LDL(mmol/L)脂联素(μg/ml)ACI组1.88±1.51 1.19±0.25 3.23±0.73 4.1±1.5对照组 1.40±1.29 1.34±0.41 2.80±0.52 7.0±3.3 t值 7.01 11.71 27.62 76.80 P值0.009 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 脂联素SNP45位点各基因型与血清脂联素关系分析 在ACI组的APM-1 SNP45的T/T、G/T及G/G三种基因型中，脂联素的血清水平分别为(3.92±1.2)、(4.07±1.5)及(3.99±1.4)μg/ml(t=0.287，P=0.593)。同样，对照组各基因型差异也无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 脂联素SNP45位点各基因型与血清脂联素关系比较(n=120，±s)

表2 脂联素SNP45位点各基因型与血清脂联素关系比较(n=120，±s)

组别APM-1 SNP45 T/G各基因型血清脂联素(μg/ml)T/T G/T G/G t值 P值ACI组3.92±1.2 4.07±1.5 3.99±1.4 0.287 0.593对照组7.12±3.3 6.88±2.7 6.96±2.8 0.150 0.700

2.4 脂联素SNP276位点各基因型与血清脂联素关系分析在ACI组的APM-1 SNP276的 T/T、G/T及G/G三种基因型中，脂联素的血清水平分别为(4.07±1.6)、(4.01±1.4)及(3.38±0.7)μg/ml，G/G基因型与T/T基因型比较差异显著(t=29.53，P＜0.001);而对照组各基因型的差异无统计学意义(P=0.434)。对照组G/G基因型的血清脂联素与其他两种基因型比较，也有所降低，而在ACI组，G/G基因型的血清脂联素降低较其余两种基因型更为显著，由此推断，携带G/G基因型可能增加ACI患病的风险。见表3。

表3 脂联素SNP276位点各基因型与血清脂联素关系比较(n=120，±s)

表3 脂联素SNP276位点各基因型与血清脂联素关系比较(n=120，±s)

组别APM-1 SNP45 T/G各基因型血清脂联素(μg/ml)T/T G/T G/G t值 P值ACI组4.07±1.6 4.01±1.4 3.38±0.7 29.53 ＜0.001对照组6.93±2.8 6.84±2.6 6.01±2.2 0.618 0.434

3 讨论

于1995年Scherer等〔4，5〕发现的一种结构类似于补体因子q的蛋白质，而由脂肪细胞特异性分泌的物质，后来命名为脂联素。脂联素通过抑制血管内皮细胞炎症发生及白细胞的黏附，并且抑制血管平滑肌的迁移和增殖，从而抑制动脉粥样硬化的形成。脂联素还可以降低肝脏和肌肉的甘油三酯的含量，提高脂肪酸的氧化，改善脂代谢，协助增强抗动脉粥样硬化的作用。

脂联素是如何抑制动脉粥样硬化形成的机制尚未清楚。内皮细胞损伤被认为是动脉粥样硬化的病理改变初期。Ouchi等〔6〕用经脂联素处理后的人主动脉内皮细胞研究发现，脂联素对巨噬细胞的形成及吞噬细胞作用以及单核细胞的黏附都有一定的影响，表现在拮抗肿瘤坏死因子(TNF)-α的生成与发生作用。内皮细胞被TNF-α激活后，通过NF-κB信号通路使黏附分子如VCAM-1、ICAM-1及E-selectin的mRNA表达上调，使得单核细胞黏附于内皮细胞表面增多，形成动脉粥样斑块，这是动脉粥样硬化疾病发生、发展的关键步骤。

人脂联素基因(APM-1)进行序列分析后发现，APM-1在正常人中存在一定数量的等位基因SNPs，其编码蛋白质的氨基酸序列不受密码子改变的影响。到现在为止发现了分布在APM-1上游启动子、内含子与外显子等多个区域的十多种ADP常见的 SNPs及一些罕见的错义突变〔7，8〕。

本文结果显示海南汉族人群中，ACI患者血清脂联素水平明显低于健康人群，ACI患者APM-1 SNP276位点多态性与血清脂联素水平有关，G/G基因型个体的血清脂联素水平较低，携带APM-1 SNP276 G/G基因型可能增加ACI患病的风险。

1 张 成，刘焯霖.重视脑血管病的遗传学研究〔J〕.中华神经科杂志，1999;32(5):262-4.

2 Adamczak M，Wiecek A，Funahashi T，et al.Decreased plasma adiponectin concentrations in patients with essential hypertension〔J〕.Am J Hypertens，2003;16(1):72-5.

3 毕 楠.一个新的脂肪因子——脂联素的结构与功能的研究进展〔J〕.中国动脉硬化杂志，2005;13(4):520-2.

4 Yan WL，Chen SF，Huang JF，et al.Common SNPs of APM-Ⅰ gene are not associated with hypertension or obesity in Chinese population〔J〕.Biomed Environ Sci，2006;19(3):179-84.

5 Hegener HH，Lee IM，Cook NR，et al.Association of adiponectin gene variations with risk of incident myocardial infarction and ischemic stroke:a nested case-control study〔J〕.Clin Chem，2006;52(11):2021-7.

6 Ouchi N，Kihara S，Arita Y，et al.Adiponectin，an adipocyte-derived plasma protein，inhibits endothelial NF-κB signaling through a camp-dependent pathway〔J〕.Circulation，2000;102(11):1296-301.

7 Hara K，Boutin P，Mori Y，et al.Genetic variation in the gene encoding adiponectin is associated with an increased risk of type 2 diabetes in the Japanese population〔J〕.Diabetes，2002;51(12):536-40.

8 Vasseur F，Helbecque N，Dina C，et al.Single-nucleotide polymorphism haplotypes in the both proximal promoter and exon 3 of the APM-1 gene modulate adipocyte-secreted adiponectin hormone levels and contribute to the genetic risk for type 2 diabetes in French Caucasians〔J〕.Hum Mol Genet，2002;11(21):2607-14.