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顺铂联合热疗对人胃癌耐药细胞增殖及耐药相关基因Survivin表达的影响

2013-09-18河北医科大学第四医院化疗科河北石家庄0500

中国老年学杂志 2013年13期
关键词:热疗细胞周期耐药

董 倩 陈 虎(河北医科大学第四医院化疗科,河北 石家庄 0500)

肿瘤产生多药耐药(MDR)是化疗失败的重要原因之一,寻找能够逆转耐药的方法成为当前的重要研究方向之一。目前发现热疗可能通过不同的作用机制,抑制肿瘤的生长,逆转肿瘤耐药,从而对化疗起到协同和增效的作用〔1〕。本研究通过顺铂联合热疗作用于人胃腺癌耐药细胞株SGC7901/DDP,并观察其对细胞增殖及Survivin表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃腺癌耐药细胞株SGC7901/DDP(购买于南京凯基生物有限公司),置于RPMI1640培养液中,加入浓度为1 μg/ml的顺铂(山东齐鲁制药有限公司产品,批号是9080372DC)以维持耐药性。兔抗人Survivin多克隆抗体(河北博海生物工程开发有限公司)。

1.2 分组 取对数生长期细胞,常规胰蛋白酶消化后,以5.0×105/瓶接种于25 ml培养瓶中,培养24 h待细胞贴壁后,用含顺铂0.1 μg/ml的RPMI1640培养基换液。热疗组、热化疗组在43℃恒温水浴箱中加热2 h后,与对照组、化疗组同时继续于37℃、5%CO2培养箱中继续培养至24 h。常规消化收集细胞,PBS液离心洗涤2遍,用70%冷乙醇(4℃)固定;调整细胞浓度为1.0×106/ml,取 1 ml单细胞悬液,加入兔抗人Survivin抗体 0.1 ml(工作浓度1∶50),室温孵育 30 min,PBS液洗3次;分别加入羊抗兔 IgG二抗工作液100 μl,避光室温孵育30 min,PBS液洗3次后上机检测。设PBS代替一抗和二抗的阴性对照以及只加二抗的本底对照。

1.3 方法

1.3.1 FCM法检测细胞周期分布和细胞凋亡 取对数生长期细胞,用PBS液洗涤2次,再用盐水洗涤2次,弃去上清,加入溴化丙啶1 ml染色,冰浴30 min,铜网过滤制成单细胞悬液,用流式细胞仪对细胞的DNA定量分析,计算出细胞周期的时相分布和凋亡率,按公式计算增殖指数(PI)。

1.3.2 FCM法半定量检测细胞的Survivin蛋白的表达 取对数生长期的细胞,各组均重复3瓶。常规消化收集细胞,PBS液离心洗涤2次,用70%冷乙醇(4℃)固定;调整细胞浓度为1.0×106/ml,取1 ml单细胞悬液,加入兔抗人 Survivin抗体0.1 ml(工作浓度1∶50),室温孵育30 min,PBS液洗3次;分别加入羊抗兔IgG二抗工作液100 μl,避光室温孵育30 min,PBS液洗3次后上机检测。设PBS代替一抗和二抗的阴性对照,以及只加二抗的本底对照。以荧光指数(FI)表示蛋白表达的相对含量。均道值(平均荧光强度)=lg(测量值)×340。FI=实验样品均道值/对照样品均道值。

1.3.3 RT-PCR法半定量检测细胞的Survivin mRNA表达 取对数生长期细胞,各组均重复3瓶。用Trizol提取总RNA,电泳进行总 RNA完整性检测。各取2 μl测其260 nm和280 nm光密度值(OD260 nm和OD280 nm),比值在1.8~2.0之间,说明RNA纯度较高,可进行下一步检测。将各组RNA标本逆转录生成cDNA,PCR反应检测各组细胞Survivin基因的转录情况。以GAPDH作为内参,片段长度为452 bp,上游引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCACT-3',下游引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。反应条件为94℃ 5 min,94℃ 1 min,64℃ 40 s,72℃ 30 s,循环35次。设计 Survivin片段大小为447 bp,上游引物 5'-GCATGGGTGCCCCGACGTTG-3',下游引物5'-GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA-3',反应条件为 94℃ 2 min,94℃ 45 s,68℃ 45 s,72℃ 1 min,循环35次。上述PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳。应用1D Image Analysis Software进行表达强度分析,同时以GAPDH作为内参照。相对系数=细胞PCR产物表达强度/GAPDH表达强度。

1.4 统计学分析 采用SPSS11.0统计软件包,计量资料以±s表示,符合正态分布的计量资料组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 各组FCM检测细胞增殖的比较 与对照组相比,化疗组各细胞周期无明显变化(P>0.05)。热疗组、热化疗组G0/G1期的细胞比例逐渐提高,而S期的细胞比例明显降低(P<0.05)。与对照组及化疗组相比,热疗组G2/M其细胞比例增多,但不具有显著性(P>0.05)。热化疗组相比各组各期细胞比例变化均具有显著性差异(P<0.05)。与对照组相比,化疗组、热疗组PI虽然有所降低,但无显著性差异(P>0.05),而热化疗组与各组相比PI明显降低(P<0.05)。见表1。

2.2 各组细胞Survivin蛋白表达的比较 对照组、化疗组、热疗组、热化疗组Survivin FI值分别为:1.000±0.000,1.011±0.016,0.736 ±0.008,0.629 ±0.022。与对照组相比,化疗组 FI值无显著性差异(P>0.05),而热疗组、热化疗组的GST-π蛋白表达的FI值逐步降低,并均具有显著性差异(P<0.01)。

表1 各组细胞周期及PI变化(±s,%,n=3)

表1 各组细胞周期及PI变化(±s,%,n=3)

1)与对照组比较;2)与化疗组比较;3)与热疗组比较:均P<0.05

组别 G0/G1 S G2/M PI对照组 43.81±2.11 40.30±0.80 15.89±2.56 84.11±2.56化疗组 43.65±2.28 40.38±0.77 15.97±3.04 84.03±3.04热疗组 48.20±0.291)2)34.50±1.501)2) 17.30±1.79 82.70±1.79热化疗组 61.16±1.651)2)3)16.68±0.851)2)3)22.16±2.311)2)3)77.84±2.321)2)3)

2.3 各组细胞的Survivin mRNA表达的比较 对照组、化疗组、热疗组、热化疗组 Survivin mRNA半定量值分别为:15.367 ±0.702,15.833 ±0.702,7.600 ±0.436,5.600 ±0.500。与对照组相比,化疗组无显著差异(P>0.05),而热疗组、热化疗组Survivin mRNA表达逐步降低,并均有极显著差异(P<0.01)。

3 讨论

MDR的产生归因于许多因素,包括细胞内药物外排及胞内药物重分布、启动细胞内解毒系统、拓扑异构酶II蛋白含量及活性下降,DNA的修复损伤能力增强、细胞抗凋亡机制的参与等。

热诱导细胞凋亡是热疗杀伤肿瘤细胞的主要机制〔2,3〕。Zhang等〔4〕研究显示奥沙利铂对肿瘤细胞的生长抑制作用具有温度依赖性,发现在50 μg/ml的奥沙利铂作用下,43℃对肿瘤细胞的抑制作用最强。并且研究表明热疗可引起G0/G1期细胞周期阻滞,并通过上调P53,Bax表达和下调 Bcl-2来促进Lovo细胞凋亡。Walther等〔5〕通过体内外41℃ ~43℃加热处理人类结肠癌细胞HCT15和HCT16后,运用酶联免疫吸附试验测定热疗前后TNF-α和多药耐药基因抑制基因(CAT)的表达,结果表明TNF-α分泌和CAT表达显著增强,P糖蛋白(P-gp)、多药抗药性相关蛋白(MRP)和肺多药抗药性相关蛋白(LRP)表达均显著减弱,这在一定程度上提示,热化疗可以抑制P-gp和MRP表达,逆转肿瘤多药耐药性。

本研究发现热疗及顺铂联合热疗都可以使人胃癌耐药细胞SGC7901/DDP的G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,G2/M期细胞相对增多,并且顺铂联合热疗作用效果最明显。这可能是热疗将细胞抑制于G1期,而G1期正是化疗药物作用的敏感点〔6〕,所以逆转了耐药肿瘤细胞对化疗的敏感性。

Survivin是细胞凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成员,具有抑制细胞凋亡的作用,在肿瘤的形成过程中起着关键的作用〔7〕。它广泛表达于人的胚胎组织和各种肿瘤组织,但在正常成人分化组织中(胸腺、生殖器除外)检测不到。Survivin mRNA在细胞周期中的G2/M期特异性高表达,其过度表达若超越细胞自身的周期调控时,就会导致肿瘤的形成;相反,Survivin基因缺失的细胞也不能正常进行细胞分裂〔8,9〕。多项研究发现〔10,11〕,抑制Survivin的表达可以抑制肿瘤细胞的增殖,并且能够增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。

本研究中,单纯热疗及顺铂联合热疗作用后,SGC7901/DDP细胞中Survivin蛋白及mRNA的表达明显的下降,并且并顺铂联合热疗作用后下降最明显。由此推测,热疗可能通过抑制Survivin蛋白的生成及Survivin mRNA的表达,来增强耐药肿瘤细胞对化疗的敏感性。

综上,热疗联合顺铂化疗对人胃癌耐药细胞SGC7901/DDP具有明显的抑制作用,然而肿瘤耐药的机制是复杂的,热疗逆转肿瘤耐药的机制需要进一步研究。

1 董 倩,陈 虎,孔 雁,等.肿瘤热化疗研究进展〔J〕.肿瘤研究与临床2009;21(7):499-501.

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3 Ashush H,Rozenszajn LA,Blass M,et al.Apoptosis induction of human myeloid leukemic cells by ultrasound exposure〔J〕.Cancer Res,2000;60(4):1014.

4 Zhang XL,Hu AB,Cui SZ,et al.Thermotherapy enhances oxaliplatin-induced cytotoxicity in human colon carcinoma cells〔J〕.World J Gastroenterol,2012;18(7):646-53.

5 Walther W,Stein U,Schlag PM.Use of the human MDR1 promoter for heat-inducible expression of therapeutic genes〔J〕.Int J Cancer,2002;98(2):291-6.

6 Shao J,Lee SB,Guo H,et al.Prostaglandin E2 stimulates the growth of colon cancer cells via induction of amphiregulin〔J〕.Cancer Res,2003;63(17):5218-23.

7 Altieri DC.Survivin and IAP proteins in cell-death mechanisms〔J〕.Biochem J,2010;430(2):199-205.

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11 Shen X,Zheng JY,Shi H,et al.Survivin knockdown enhances gastric cancer cell sensitivity to radiation and chemotherapy in vitro and in nude mice〔J〕.Am J Med Sci,2012;344(1):52-8.

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