深部热疗对AD离体细胞治疗模式的探索及疗效

陈剑虹 王小璞 农海宁 鲍 晋 卢宜民

广州中医药大学祈福医院, 广东 广州 511495

深部热疗对AD离体细胞治疗模式的探索及疗效

陈剑虹 王小璞 农海宁 鲍 晋 卢宜民*

广州中医药大学祈福医院, 广东 广州 511495

目的：探索深部热疗对AD离体细胞的最佳治疗模式并评估治疗效果。方法：制备离体AD细胞模型，随机分成对照组、对照组热疗组、AD模型组、AD模型热疗组，分别置于41.5℃加热30、45、60、75、90min，于600nm处测吸光度(A)值，计算最佳热疗时间。造模成AD细胞后置于41.5℃加热60min，加热后继续置于37℃恒温孵育24h，分别于加热后2、4、8、12、24、72h取出，使用流式细胞仪行活细胞膜HSP70表达量，计算最佳热疗间隔时间。4组细胞热疗后分别加入20μmol/L的Aβ25-35溶液培养24h，应用流式细胞仪检测细胞活力，评估热疗治疗AD效果。结果：对照组和AD模型组分别给予不同时间41.5℃热疗，两组细胞从加热60min开始细胞增殖趋势与非加热细胞相比开始下降(P<0.05)，这种下降趋势在75min达到最大，确定细胞加热的安全有效时间为60min，同时对照热疗组与AD模型热疗组对比，两组细胞随温度变化的细胞增殖趋势基本相同，两者比较无统计学差异(P>0.05)，表明两组细胞的最佳热疗时间均为60min。AD模型组细胞在热疗后2、4、8、12、24及72h各时间段监测的HSP70表达量均不同，AD细胞在24hHSP70表达量均达到最大值(P<0.05)，其后HSP70表达量开始下降，表明24h是最佳的热疗间隔时间。4组细胞与Aβ作用后加热，MTT检测表明4组细胞活力呈温度依赖性上升趋势(P<0.05)，表明热疗可有效的减少Aβ的聚集，促进Aβ的清除，保护AD细胞。结论：深部热疗对AD离体细胞的最佳热疗时间为60min，最佳热疗间隔时间为24h，深部热疗可以有效的清除Aβ，促进神经元细胞修复。

深部热疗; AD; 离体细胞; 治疗模式

阿尔茨海默病(Alzheimer Disease，AD)，是一种中枢神经系统变性病，起病隐匿，以进行性记忆力障碍、认知障碍和精神异常为主要临床特征的一种老年痴呆性疾病[1]。AD病理特征是神经元细胞外液β蛋白(β-amyloid，Aβ)沉积形成神经炎性斑，神经元内神经纤维沉结以及海马皮层区域神经元的大量丢失[2]。近年来大量研究发现，AD患者颅脑内神经元中热休克蛋白(Heat Shock Protein，HSP)表达较正常人明显减少。神经元细胞在加热或其他损伤性刺激时会产生保护性的HSP，其中HSP70是中枢神经系统含量最丰富的HSP，其具有抑制Aβ聚集，从而保护神经元的作用[3]。本实验通过给P12神经细胞株注射Aβ25-35建立AD细胞模型，观察不同热疗时间，不同热疗间隔期对AD细胞的活性及HSP70的表达，探索深部热疗对AD细胞的最佳治疗模式并评估治疗效果。

1 材料与方法

1.1 材料 Aβ25-35、二甲基亚矾(DMSO)和四甲基偶氮唑盐(MTT)均为美国Sigma公司产品；其余均为国产分析纯试剂。仪器：倒置相差显微镜由日本Olympus公司购进；恒温CO2培养箱为美国Thermo公司；FACSCalibur流式细胞仪由美国BectonDicknson公司购进；多功能酶标仪由德国BMG公司购进。

1.2 试验方法

1.2.1 观察在离体细胞水平 观察热疗后HSP70的表达，摸索安全的热疗加热时间及最佳的热疗间隔时间。

1.2.1.1 制备离体AD细胞模型 给予20μmol/L Aβ25-35孵育神经细胞株P12细胞(由暨南大学提供)培养24h。

1.2.1.2 选择合适的热疗时间 取对数生长期P12细胞，以1×104个细胞，100uL/孔接种于96孔培养板，继续于孵育箱中培养24h，随机分成对照组、对照组热疗组、AD模型组、AD模型热疗组，分别置于41.5℃加热30、45、60、75、90min，每个时间点各组设5个复孔，实验结束后，每孔加5mg/mL MTT0.015mL，置CO2培养箱内培养4h，弃上清，每孔加0.15mL DMSO，充分震荡后，于600nm处测吸光度(A)值。

1.2.1.3 选择合适的热疗间隔时间 热效应存在热耐受性，现根据HSP70的表达量变化明确最佳热疗间隔时间。取对数生长期P12细胞，以1×104个细胞，100ul/孔接种于96孔培养板，继续于孵育箱中培养24h，造模成AD细胞后置于41.5℃加热Xmin(根据1.2.1.2摸索出的时间)，加热后继续置于37℃恒温孵育24h，分别于加热后2、4、8、12、24、72h取出，加荧光标记的抗HSP70mAb，使用流式细胞仪行活细胞膜HSP70表达量，根据HSP70表达量的变化趋势避开AD细胞的热耐受期，选择最佳的热疗间隔时间(Y h)。

1.2.2 标准热疗后离体细胞水平下观察各组细胞的细胞活力 进一步研究热疗在治疗AD中的可能作用。①随机分成4组，分别为P12对照组、P12对照组+热疗组(热疗Xmin，间隔Yh再次给予热疗1次)、AD模型组、AD模型组+热疗组(造模后给药热疗Xmin，间隔Yh再次给予热疗1次)并且末次热疗后更换培养基，继续培养24h。②Aβ25-35溶解后配成0.5mg/mL溶液，37℃、5%CO2培养箱培养，-20℃保存备用，使用前稀释、过滤。③4组细胞内加入20μmol/L的Aβ25-35溶液培养24h后给予5g/LMTT20μl孵育4h，弃上清加100μL二甲基亚砜(DMSO)，在酶联免疫检测仪570nm波长下测定各孔光吸收值，并将其与正常对照组吸光度的比值作为相对细胞活力。④流式细胞仪测定细胞凋亡：应用AnnexinV-PI双染色检测细胞凋亡。细胞按1×105/孔的密度接种在6孔板中，给予Aβ25-35干预6h后用PBS洗涤2次，室温避光反应15min，应用流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 不同热疗时间对各组细胞活力的影响 对照组和AD模型组分别给予不同时间41.5℃热疗，两组细胞在加热初期(30min和45min)，细胞增殖趋势分别与其对应的非加热细胞相比相差不大；从60min开始加热细胞增殖趋势与非加热细胞相比开始下降(P<0.05)，这种下降趋势在75min达到最大，即此时在两种培养条件下细胞的平均A值差距最大，确定细胞加热的安全有效时间为60min，见图1。对照热疗组与AD模型热疗组对比，两组细胞随温度变化的细胞增殖趋势基本相同，两者比较无明显统计学差异(P>0.05)，表明两组细胞的最佳热疗时间均为60min。见图2。

2.2 不同热疗时间对AD细胞HSP70表达的影响 AD模型组细胞在热疗后2、4、8、12、24及72h各时间段监测的HSP70表达量均不同，AD细胞在24hHSP70表达量均达到最大值(P<0.05)，其后HSP70表达量开始下降，表明24h是最佳的热疗间隔时间。见图3。

2.3 深部热疗对各组细胞存活率的影响 MTT检测结果显示，Aβ对两组细胞的细胞毒性与温度相关，热疗使温度升高后作用于P12细胞或AD细胞，使细胞活力呈温度依赖性上升趋势(P<0.05)，高温对细胞活力有明显提升作用，表明热疗可有效的减少Aβ的聚集，促进Aβ的清除，保护AD细胞，促进神经元细胞修复。见表1。

组别样本量吸光度值存活率/%P12对照组50.741±0.01480.27±4.45P12对照组+热疗组50.643±0.022*87.46±2.21AD模型组50.736±0.00958.41±3.53AD模型组+热疗组50.619±0.017*72.02±4.18

注：与非热疗组比较，*P<0.05。

3 讨论

AD是老年痴呆中最常见的一种类型，其临床特点为记忆障碍、认知障碍和精神异常等，病情渐进性加重，严重影响生活与社交，其患病率随年龄增高而增高，在65岁以上人群中约为5%，85岁以上人群中约20%，其中印度、中国等亚洲发展中国家患病率增加最为明显[4]。

3.1 深部热疗对热休克蛋白的影响 热休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs)是指各种应激刺激时细胞新合成或合成增加的一类蛋白质，它作为体内重要的分子伴侣之一，参与蛋白质的合成、折叠、装配、转运和降解等过程，以维持细胞蛋白自稳，提高细胞对应激原的耐受性，并有助于细胞恢复正常的结构和机能[5]。深部热疗是利用高温产生热刺激作用在AD患者神经中枢，神经细胞在热刺激反应后，会发生蛋白质图谱的改变，表现为正常蛋白合成被抑制，应激蛋白HSP合成增加，从而达到减少Aβ聚集，减少寡聚体的形成，减轻神经元细胞的损伤[6-7]。近年来深部热疗作为一种无创、无痛苦、治疗费用相对低廉、无明显毒副作用的治疗方法，临床广泛应用于恶性肿瘤和炎症性疾病，并取得较好的临床收益。大量的基础研究表明，能够产生热休克蛋白的深部热疗在AD患者的临床治疗上具备潜力，但缺乏系统规范的治疗模式的探讨及治疗效果的评估[8]。本研究在离体细胞水平，在加热的不同时间，通过MTT法测定细胞活力，AD细胞在加热初期(30min和45min)，细胞增殖趋势分别与其对应的非加热细胞相比相差不大；从60min开始加热细胞增殖趋势与非加热细胞相比开始下降(P<0.05)，表明AD细胞热疗的最佳时间为60min。此后AD模型组在加热60min后观察AD细胞在加热后不通时间段的HSP的表达，结果表明AD细胞在24hHSP70表达量均达到最大值(P<0.05)，说明AD细胞体外加热的最佳时间间隔为24h。

3.2 深部热疗对Aβ释放的作用 Aβ是淀粉样蛋白前体蛋白(Amyloid Precursor Protein, APP)在人体代谢的正常产物之一，神经细胞，尤其是神经胶质细胞产生Aβ后，向细胞外释放，进入脑脊液，最终被脑啡肽酶和内皮素转换酶分解清除。在AD患者中，随着pH值改变和载脂蛋白E的增多导致Aβ的产生和清除失衡，使Aβ在神经元外聚集，发挥神经毒性作用，最终引起记忆缺失[9-10]。研究表明，热休克蛋白可以有效的促进Aβ的清除，减少tau蛋白的过度磷酸化，减少神经元的丢失，促进神经突触的可塑性，发挥保护神经细胞的作用[11-12]。 本研究中给P12神经细胞及AD细胞分别加热，均加热60min/次，间隔24h重复加热1次，其后将4组细胞与Aβ溶液进行培养，热疗组细胞的存活率明显高于非热疗组。研究表明热疗对神经细胞均有明显保护作用，热疗产生的HSP可以有效的减少Aβ在神经元上的沉淀，促进Aβ的清除，保护AD细胞。

深部热疗可以刺激神经细胞产生大量热休克蛋白，热休克蛋白通过参与蛋白质的合成、折叠、装配、转运和降解等过程，以维持神经细胞蛋白自稳，提高细胞对应激原的耐受性，恢复AD细胞正常的结构和功能[13-14]。本研究试验在离体细胞水平探讨AD的治疗模式为每次AD细胞热疗的最佳时间为60min，间隔24h重复加热1次，可以有效抑制Aβ聚集，从而保护神经元细胞。未来，进一步的研究中我们将继续探索大鼠头部热疗治疗AD的模式和效果，并与离体细胞水平的治疗相对比，我们期待可以在将来为深部热疗在AD患者的临床治疗提供前期的理论与实验基础。

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The Exploration and Curative Effect of Deep Hyperthermia Treatment Model on Isolated AD Cells

CHEN Jianhong WANG Xiaopu NONG Haining BAO Jin LU Yimin*

Clifford Hospital, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 511495,China

Objective To explore the best treatment model of deep hyperthermia on isolated AD cells and evaluate its curative effect.Methods Isolated AD cells models were made ready and randomly divided into control group and hyperthermia control group, AD model group, AD model hyperthermia group. Each group was separately heated at the level of 41.5℃ for 30, 45, 60, 75, 90min，the absorbance(A) value was tested at 600 nm, and then the best hyperthermia treatment time was calculated. The ready made AD cells were heated for 60 minutes at the level of 41.5℃ and then continued to be incubated in thermotank for 24 hours at the level of 37℃ after the heating. The cells were separately taken out after 2, 4, 8, 12, 24 and 72h. Flow Cytometer was used to test the expression level of the AD cells HSP70, and the best interval of hyperthermia treatment was calculated. 4 groups of the cells were put into the Aβ25-3solution of 20μmol/L concentration to cultivate for 24 hours. The cell viability was tested by using flow cytometer to evaluate the hyperthermia treatment effects on AD. Results The control group and AD model group were separately given hyperthermia at the level of 41.5℃，the Cell proliferation trend of the two groups of cells began to decline compared with the non-heated cells(P<0.05). This trend came to the maximum at the 75th minute, and accordingly the safe and effective time length of heating on the cells was set for 60 minuets. The control hyperthermia compared with the AD model hyperthermia group, the Cell proliferation trend of the two groups which varied according to the temperature changes was generally the same, and no statistic significance was found between the two groups(P>0.05), which showed the best treatment time length of the two groups of cells was 60 minutes. The HSP70 expression level of AD model group was tested differently after the cells were heated 2, 4, 8, 12, 24 and 72h. The HSP70 expression level of AD cells was tested the top at 24h, then it began to decline. This showed the best treatment interval was 24 hours. The four groups of cells were mixed with Aβ and the mixture was then heated. MTT showed the viability of the four groups of cells was on the rising trend with temperature dependence(P<0.05), which showed hyperthermia could effectively reduce the gather of Aβ and help clear Aβ, AD cells were protected accordingly.Conclusions The best treatment time length of deep hyperthermia on isolated AD cells was 60 minutes, the best hyperthermia treatment interval was 24 hours, deep hyperthermia could effectively clear Aβ and help repair the neuron cells.

Hyperthermia; AD; Isolated Cell; Treatment Model

陈剑虹(1979 -)，男，汉族，本科，主治医师，研究方向为老年病方向。E-mail：570686858@qq.com

卢宜民(1964 -)，男，汉族，本科，主任医师，研究方向为肿瘤热疗学。E-mail：gzlym-10@163.com

R-331

A

1007-8517(2017)15-0058-04

2017-05-25 编辑：梁志庆)