不同产地苦丁茶多糖的提取

黄敏桃吴尤娇黄云峰

HUANG Min－tao1，2WU You－jiao1，2HUANG Yun－feng3

赖茂祥3黄庶识1刘华钢4

LAI Mao－xiang3HUANG Shu－shi1LIU Hua－gang4

（1.广西科学院生物物理实验室，广西 南宁 530007；2.广西中医药大学药学院，广西 南宁 530001；3.广西中医药研究院，广西 南宁 530022；4.广西医科大学，广西 南宁 530021）

苦丁茶（IlexkudingchaC.J.Tseng）为冬青科冬青属苦丁茶种常绿乔木，主要分布在广西、广东、福建等长江以南地区［1］。苦丁茶含有三萜类、黄酮类、氨基酸、脂多糖和多种微量元素［2，3］等活性成分，是民间常用的中草药和传统的保健饮料。研究表明，植物多糖是一种多功能的活性物质［4－7］。苦丁茶多糖是苦丁茶主要活性成分，具有抗氧化［8－10］、降血脂［11］及抗病原菌［12，13］等生物活性功能，有很好的应用前景。前人［9－12］研究苦丁茶多糖均先提取粗多糖纯化后再测定其提取率，纯化过程中会流失一小部分多糖，而本研究直接测定提取液中的多糖含量，结果更接近药材中的含量。结合文献［8～13］研究多糖的一系列药理作用与现代应用，测定不同产地苦丁茶水提液中的多糖含量具有一定的现实意义。

本研究以广西、广东、海南苦丁茶为研究对象，采用响应面法优化多糖最佳提取工艺，苯酚－硫酸法测定不同产地的多糖含量，为苦丁茶质量标准制定及苦丁茶多糖药物及功能性食品的开发研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

苦丁茶：2011年7月至2012年8月采摘自不同产地的各种栽培及野生苦丁茶见表1，经鉴定为冬青科冬青属苦丁茶冬青 （IlexkudingchaC.J.Tseng），采回后晾干，粉碎，备用。

表1 苦丁茶不同产地样品Table1 Ilex kudingcha C.J.Tsengsamples from different localities

1.1.2 试剂

浓硫酸：分析纯，廉江市爱廉化试剂有限公司；苯酚：分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司；葡萄糖：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

试验用水：超纯水，本实验室自制。

1.1.3 仪器电子天平：BS224S型，北京赛多利斯仪器系统有限公司；双光束紫外可见分光光度计：TU－1901型，北京普析通用仪器有限责任公司；

旋转蒸发仪；RE－52AA型，上海亚荣生化仪器厂；

循环水式真空泵：SHB－B型，郑州长城科工贸有限公司；超声机：B3200S－T型，必能信超声有限公司；

数显恒温水浴锅：HH－8型，国华电器有限公司；

实验室超纯水仪：OKP－S010型，上海涞科实业发展有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 对照品溶液的制备 精密称取标准无水葡萄糖20.03mg，蒸馏水定容至100mL，再精密吸取10.00mL定容至50mL容量瓶中，得到40.06μg／mL的葡萄糖标准溶液，备用。

1.2.2 供试品溶液的制备 精密称取苦丁茶粉末5.000g，置于圆底烧瓶内，加蒸馏水至315mL，称重，加热回流120min，冷却后加蒸馏水补足重量，将滤液稀释20倍，备用。

1.2.3 测定波长的选择 以上述浓度的葡萄糖对照品溶液，按苯酚－硫酸法在200～800nm范围内扫描，选择最大吸收波长作为苦丁茶多糖的测定波长。

1.2.4 线性关系考察 精密吸取上述对照品溶液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8mL 于试管中，并用水补足至2.0mL，得系列对照品溶液。分别加入1mL 6%苯酚溶液及5.0mL浓硫酸，待各管加完后摇匀，室温静置30min，482nm测吸光度，再精密吸取2.0mL蒸馏水，同法操作，作空白对照。以吸光度为纵坐标（y），葡萄糖浓度为横坐标（x），绘制标准曲线。

1.2.5 单因素试验设计

（1）提取温度考察：称取5g苦丁茶粉末，加入200mL蒸馏水，分别在温度70，80，90，100℃下热水浸提120min，提取3次，合并滤液浓缩，蒸馏水定容于10mL容量瓶中，得到供试品溶液。平行3次试验。按1.2.4的方法操作，在最大吸收波长测定，得到的吸光度代入标准曲线中，根据换算公式得到总多糖含量。

（2）液料比考察：称取5g苦丁茶粉末，分别加入200，250，300，350mL的蒸馏水，以最佳温度提取120min，提取3次，合并滤液浓缩，其它操作同1.2.5（1）。

（3）提取时间考察：称取5g苦丁茶粉末，以最佳提取温度及液料比，分别提取90，120，150，180min，提取3次，合并滤液浓缩，其它操作同1.2.5（1）。

（4）提取次数考察：称取5g苦丁茶粉末，以最佳提取温度、液料比及提取时间，分别提取1，2，3，4次，合并滤液浓缩，其它操作同1.2.5（1）。

1.2.6 响应面法对提取工艺的优化 综合单因素试验结果，根据中心组合设计原理，对苦丁茶多糖提取工艺进行优化。得到最佳工艺再进行验证实验。

1.2.7 不同产地样品溶液的制备与测定 根据响应面法得到的最佳提取工艺来制备来自不同产地的苦丁茶样品溶液，再按1.2.4的方法进行多糖含量测定。

1.2.8 样品多糖含量计算 将测得的多糖吸光度代入标准曲线换算成多糖中葡萄糖浓度C1，总多糖浓度换算公式见式（1）：

式中：

C—— 样品中总多糖含量，mg／g。

C1—— 已稀释样品中换算出的葡萄糖浓度，μg／mL。

N——样品稀释倍数。

C2—— 样品生药浓度，g／mL。

2 结果与分析

2.1 测定波长选择

根据葡萄糖对照品溶液扫描结果，测定最大吸收波长为482nm。

2.2 线性关系

采用苯酚－硫酸法测定一系列葡萄糖溶液的吸光度并绘制成标准曲线，得到线性回归方程为y＝0.013 11x＋0.038 64，R2＝0.997 9，标准曲线见图1。

图1 葡萄糖标准溶液曲线Figure1 Standard curve of glucose

2.3 响应面分析法优化结果

结合单因素试验结果，选择提取温度、提取时间及液料比为试验因素（见表2），试验结果见表3，方差分析见表4、5。

表2 试验因素水平与编码表Table2 Coding of experimental factors and levels

表3 响应面试验设计及结果Table3 Design and Results of Respons Surface Experiments

表4 回归方程方差分析结果†Table4 Analysis of variance for the developed regression equation

表5 模型的可信度分析Table5 The credibility of the analysis model

采用Design Expert 7.1.6软件进行多元线性回归拟合，得回归方程Y＝73.98＋2.16A＋2.84B＋0.77C－6.71AB－3.99AC－0.23BC－5.55A2－3.04B2＋3.93C2。 方差分析结果表明，失拟项P＝0.123 5＞0.05，模型P＝0.004 5＜0.01，因此模型选择正确。相应的响应面和等高线见图2～4。

图2中响应面图显示，一定的液料比时，随着提取温度的升高，多糖含量越高；一定的提取温度时，液料比的增大也有助于多糖的提取；由等高线图可知，在提取温度为95℃、液料比为58∶1（V∶m）左右多糖浓度存在最大值。可能的原因是温度的升高加速多糖分子的扩散解附作用，从而增加浸出率，液料比的增大使细胞内外多糖的浓度差变大从而易于从细胞中溶出。

图3响应面图显示，提取时间一定时，提取温度的增加促进多糖浸出，在120min时温度达到97.5℃左右具有较高的多糖含量，在180min时温度95℃左右多糖含量较高，等高线图可以看出两种情况的多糖含量均在75mg／g以上。考虑到时间过长则可能破坏有效活性成分，在省时的情况下适当提高温度即可达到最大值，故选择120min作为提取时间，97.5℃作为提取温度。

图2 提取温度与液料比对多糖提取率的响应面与等高线Figure2 Response surface and contour plots for the effects of extraction temperature and liquid ratio on polysaccharide extraction yield

图3 提取温度与提取时间对多糖提取率的响应面与等高线Figure3 Response surface and contour plots for the effects of extraction temperature and extraction time on polysaccharide extraction yield

由图4响应面曲线的弯曲程度说明液料比对多糖含量影响比提取时间显著，液料比在63∶1（V∶m）左右多糖浓度高达78mg／g，在此液料比值之后多糖含量下降，证明合适的液料比有利于多糖浸出，可能的机理是液料比增大提高细胞内与细胞外的浓度差，促进多糖分子向细胞外渗出，到一定的值之后，多糖浸出已达到最大值，溶剂量的增大则起到稀释多糖浓度的作用，故多糖含量有所下降。

图4 液料比与提取时间对多糖提取率的响应面与等高线Figure4 Response surface and contour plots for the effects of liquid ratio and extraction time on polysaccharide extraction yield

根据上述分析结果调整得出最佳工艺参数为提取时间120min，提取温度98℃，液料比63∶1（V∶m）。平行3次实验，平均含糖量为 77.480mg／g，与理论预测值78.272mg／g相对误差为1.02%，在可接受范围内。

2.4 苦丁茶多糖含量的测定

称取不同产地苦丁茶样品各5.0g，按上述最佳提取条件（提取温度98℃、液料比63∶1（V∶m）、提取时间120min、提取3次）进行多糖的提取，滤液稀释20倍后再精密吸取2.0mL，按测定标准曲线同样方法操作，结果见表6。

由表6可知：

（1）不同产地整体对比中，广西产地＞广东产地＞海南产地。

表6 不同产地苦丁茶多糖含量Table6 Content of polysaccharide of Ilex kudingcha C.J.Tsengfrom different localities（n＝3）

（2）比较海南和广西7、8月份采集的样品，海南苦丁茶多糖含量均比广西苦丁茶多糖含量低，可能是海南气候比较炎热，增加多糖的消耗量。

（3）在同属广西产地中，大新县的苦丁茶多糖含量最高；对于广西本地苦丁茶不同的采收时间，7月份的多糖含量比12月份的高，可能是由于7月份阳光充足，而12月份气候寒冷不利于植物合成多糖。

（4）野生品与栽培种相比较，栽培种的苦丁茶多糖含量明显比野生品要高，栽培种在人工培养下所需要的生长养料比野生的丰富，生长环境较稳定，从而利于多糖生成。

3 结论

（1）本试验采用苯酚－硫酸法测定多糖含量，操作简单。在单因素考察的基础上，利用响应面法来对苦丁茶多糖提取工艺进行优化，确定最佳提取工艺为提取温度98℃、液料比63∶1（V∶m）、提取时间120min、提取3次。

（2）不同产地其苦丁茶多糖含量具有显著差异，以广西天等、大新的含量最高，广西苦丁茶多糖含量整体比广东及海南的高。据《广西万承苦丁茶》一书记载：早在元朝期间就被指定为朝廷“贡茶”；《辞海》中有“苦丁茶者，广西特产茶也，产于万承县苦丁乡”的记载（今大新县龙门乡苦丁村），广西大新是广西苦丁茶最主要的栽培基地，由此推断大新拥有更利于苦丁茶生长的环境条件。试验结果显示广西大新的苦丁茶多糖含量与其他产地有显著差别，结合前人［8－13］药理试验结果，苦丁茶特异性多糖具有一系列的药理活性，符合自古以来广西大新苦丁茶为“正宗苦丁茶”的结论［1］。

（3）由于本研究所选样品仅限于广西、广东及海南这3个省份，对其他省份地区苦丁茶样品没有采集，而且不同时间的样品采集不齐全，具有一定的局限性，还需要进一步的研究。

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