姜黄素PLGA-TPGS纳米粒的制备和质量评价

孙 辉，高 萌，蒋 妮，鲍 旭，李 磊，李 镇，田 燕

(1.解放军210医院 药剂科，辽宁 大连 116001;2.大连医科大学 药学院，辽宁 大连 116044;3.大连儿童医院 药剂科，辽宁 大连 116001)

姜黄素PLGA-TPGS纳米粒的制备和质量评价

孙 辉1，高 萌2，蒋 妮3，鲍 旭2，李 磊2，李 镇2，田 燕2

(1.解放军210医院 药剂科，辽宁 大连 116001;2.大连医科大学 药学院，辽宁 大连 116044;3.大连儿童医院 药剂科，辽宁 大连 116001)

目的 制备姜黄素乳酸羟基乙酸共聚物-水溶性维生素E纳米粒(CM-PLGA-TPGS-NPs，简称CPTN)并评价其质量。方法 用自制的PLGA-TPGS为载体材料，采用超声乳化-溶剂挥发法制备CPTN，通过粒径、Zeta电位、载药量、包封率和体外释放度控制其质量。采用RP-HPLC法，色谱柱为KROMASIL柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，用乙腈-2%冰醋酸溶液(58∶42)为流动相，检测波长为430 nm。结果 自制CPTN的平均粒径为(197.9 ±6.2)nm，Zeta电位为( -22.3±1.8)mV，载药量为(13.2 ±0.9)%和包封率为(79.3 ±1.6)%。体外姜黄素在含0.5%十二烷基硫酸钠的磷酸盐缓冲液(pH7.4)中呈两相释放，30 d时累积释放率为91.3%。结论 CPTN质量稳定可控，体外试验显示具有明显的缓释作用。

姜黄素;乳酸羟基乙酸共聚物-水溶性维生素E;纳米粒;RP-HPLC法;体外释放度

姜黄素(curcumin，CM)是从姜科姜黄属(Curuma L.)植物姜黄、郁金、莪术等的根茎中提取出的一种天然有效成分，主要有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗炎、保肝等多种药理活性［1］，且不良反应轻微，药源充足，极具开发前景。近几年来，对姜黄素抗肿瘤的药理活性研究不断增多，众多的细胞试验和动物试验均证明了姜黄素是一种发展前景良好的天然抗癌药物［2］。但因其本身难溶于水，并且在碱性条件下不稳定，口服生物利用度非常低。

纳米粒(nanoparticles，NPs)用作药物载体发展迅速，经静脉注射入血后能够将包裹的药物浓集于肝、脾、骨髓等，降低了药物在其他组织中的分布。纳米粒的大小、表面电荷及其分布对药物的靶向性具有非常重要的影响，尤其是主动靶向到肝脏或肺部的纳米粒［3］。因此，控制纳米粒的粒径和表面电荷，有望实现对肝脏更好的靶向作用。维生素E-聚乙二醇1000琥珀酸酯(D-α-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate，TPGS)是维生素E的水溶性衍生物(也叫水溶性维生素E)，能通过抑制P蛋白改善细胞膜的渗透性，增强药物的吸收，有效地抑制癌细胞的增长，同时具有肝细胞特异性识别的作用［4］。市售材料乳酸羟基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid，PLGA)是一种生物可降解性合成高分子材料，由于其质量稳定、生物可降解和良好的可塑性，近年来被大量用作注射剂、纳米粒等制剂的材料［5］。而本试验采用的是将TPGS和PLGA合成的新型材料——乳酸羟基乙酸共聚物-水溶性维生素E(PLGA-TPGS)［6］作为载体制备纳米粒，不但可通过控制纳米粒的粒径大小和表面电荷，实现 CM对肝脏的被动靶向作用，同时由于TPGS具有肝细胞特异性识别的作用，还可使CM纳米粒具有对肝脏的主动靶向性。

鉴于CM的疏水性较强，根据该药本身的结构和性质，本试验用PLGA-TPGS为载体材料，采用超声乳化 -溶剂挥发法［7］制备姜黄素纳米粒(CM -PLGA -TPGS-NPs，简称 CPTN)，通过粒径、Zeta电位、载药量和包封率控制其质量，并与PLGA为载体制备的姜黄素-PLGA-纳米粒(CMPLGA-NPs，简称CPN)比较，考察二者的体外释放度，以期寻找出粒径适宜、载药量合理以及体外药物释放理想的纳米粒，为CPTN在体内对肝脏的主动靶向性等试验研究奠定基础，并为制备CM新制剂提供试验依据，使其具有更大的开发和应用前景。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 仪器:1200型高效液相色谱仪(美国安捷仑公司)，JY92-ⅡN超声波细胞粉碎机(宁波新芝科技股份有限公司)，NanoZS90激光粒径仪(英国Marlwern公司)，RW20数显电动搅拌机(日本IKA公司)，TGL-16C高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，冷冻干燥机FD-1C(北京德天佑科技发展有限公司)，RE-52A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，HZQ-X100恒温震荡培养箱(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)，FA1104I上皿电子天平(上海精科实业有限公司)。

1.1.2 试药:姜黄素原料药(陕西森弗生物技术有限公司，纯度95%，批号:20100513)，姜黄素对照品(成都曼思特生物科技有限公司，纯度98%，批号:20100302)，水溶性维生素E(维生素E-聚乙二醇1000琥珀酸酯，TPGS，美国Eastman化学公司)，乳酸羟基乙酸共聚物-水溶性维生素E(PLGATPGS，自制，批号:20101230)，乳酸羟基乙酸共聚物(polylactic - co - glycolic acid，PLGA，50∶50，MW 50，000，山东省医疗器械研究所，批号:12090111)，乙酸乙酯(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号:20110610)，冰醋酸(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号:20090706)，甲醇(色谱纯，美国Tedia公司，批号:907900)，氢氧化钠(分析纯，大连医药集团化玻公司，批号:20101030)，磷酸二氢钾(分析纯，天津市光复精细化工研究所，批号:20100420)，十二烷基硫酸钠(SDS，Sigma公司，批号:L5750)。

1.2 方 法

1.2.1 检测波长的确定:精密称取姜黄素对照品适量，用甲醇溶解，制成50 μg/mL的对照品溶液，在190～600 nm范围内扫描，结果见图1。结果显示，姜黄素对照品在波长为410～450 nm的范围内均有较强吸收，在430 nm处吸收最强，而所用材料在此条件下无干扰，故选择430 nm为吸收波长。

图1 紫外光谱图A.姜黄素对照品;B.材料Fig 1 The ultraviolet spectrogramA.Curcumin reference substance;B.Auxiliary material

1.2.2 色谱条件［6］:色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶(KROM ASIL C18，5 μm，4.6 mm × 150 mm);流动相:乙腈:2%冰醋酸(58∶42);检测波长:430 nm;流速:1 mL/min;柱温:室温;进样量:20 μL。精密量取姜黄素对照品5 mg和姜黄素纳米粒适量(含姜黄素约5 mg)，分别至50 mL量瓶中，用流动相溶解并定容至刻度，按上述色谱条件，分别进样，结果见图2，姜黄素保留时间在7.8 min左右，分离度符合要求。

图2 高效液相色谱图Fig 2 Reversed-phase high performance liquid chromatography

1.2.3 姜黄素纳米粒的制备:精密称取姜黄素(CM)样品20 mg 3份分别置10 mL离心管中，再精密称取PLGA-TPGS 100 mg置上述离心管中，加入8 mL乙酸乙酯，充分放置使其全部溶解;量取0.06%TPGS水溶液100 mL 3份分别置250 mL烧杯中，冰水浴400W超声条件下加入CM和PLGATPGS的乙酸乙酯溶液，超声3 min，400 r/min电动搅拌6 h，16 000 r/min高速离心15 min，洗3次，冷冻干燥24 h，得CPTN。同法制备用PLGA为载体的姜黄素 -PLGA - 纳米粒(CPN，规格11.6 mg/g，批号:20110312)

1.2.4 质量评价:(1)粒径及zeta电位:称取CPTN约2 mg加到4 mL蒸馏水中，超声分散后形成纳米粒混悬液，用激光粒度仪对其粒径和粒径分布进行分析。将纳米混悬液用蒸馏水稀释后，再采用Zeta电位仪对纳米粒表面Zeta电位进行测定。

(2)载药量和包封率的测定:①标准曲线的绘制:精密称取姜黄素对照品25 mg置25 mL量瓶中，加甲醇适量，振摇使其溶解后，再加甲醇定容至刻度，摇匀，得浓度为1 mg/mL对照贮备液。分别精密量取对照贮备液 50、100、200、400、800、1 600、3 200 μL置10 mL量瓶中，加流动相定容到刻度，摇匀，制成浓度分别为 5、10、20、40、80、160、320 μg/mL的系列对照溶液。按1.2.2色谱条件，取姜黄素系列对照液分别进样3次，每次进样量20 μL，以峰面积A对浓度C进行线性回归，得标准曲线方程为:A=110.05C+129.49，r=0.9998，姜黄素在 5 ～320 μg/mL之间线性关系良好。

②精密度试验:精密吸取姜黄素对照贮备液100、400、1600 μL 各5 份，置 10 mL 量瓶中，加流动相定容至刻度，摇匀，制成 10、40、160 μg/mL 的低、中、高3个浓度组，按1.2.4的(2)中①项下的方法连续测定5次和每天在同一时间进样、连续测定5 d，分别测定姜黄素对照贮备液的日内精密度(RSD)和日间精密度(5 d)，结果日内RSD分别为1.3%、1.2%、0.9%，日间 RSD 分别为 1.5%、1.3%、1.1%，取样精密度良好。

③重复性试验:取自制的同一批号的CPTN 5份，分别置25 mL离心管中，每份5 mg，用2 mL乙酸乙酯溶解后减压挥发乙酸乙酯，加入25 mL流动相涡旋混匀，按1.2.2色谱条件进样3次，每次20 μL，测定峰面积，结果纳米粒中CM含量的RSD为2.2%，该方法重复性好。

④相对回收率试验:精密称取自制的同一批号的CPTN 9份，分别置25 mL离心管中，每份5 mg，每3份分别精密加入1 mg/mL姜黄素对照贮备液100、200、300 μL，余下操作同 1.2.4 的(2)中③项下，于430 nm波长处测定峰面积A，根据标准曲线方程计算含量，以测得量与加入量比较，计算回收率，结果CPTN中姜黄素平均相对回收率分别为100.4%(RSD=1.9%)，此法用于测定样品含量的准确度好。

⑤稳定性试验:取自制的同一批号CPTN 4 mg 3份，制备成 80 μg/mL浓度的样品溶液，按 1.2.4的(2)中③项制备样品溶液，测定 0、0.5、1、2、4、6、12、24 h时的峰面积A，结果CPTN 4 mg在24 h内的RSD 1.1%，样品溶液在24 h内稳定。

⑥载药量和包封率的测定:取同一批号的自制的CPTN 5份，每份5 mg，分别置25 mL离心管中，用2 mL乙酸乙酯溶解后减压挥发乙酸乙酯，加入16 mL流动相涡旋混匀后16 000 r/min离心，按1.2.2色谱条件进样 3 次，每次 20 μL，测定峰面积A。

1.2.5 姜黄素释放度的测定:取15 mg CM、CPTN及本教研室自制的CPN(CPTN、CPN的载药量分别为13.3%、11.6%)，分别加入 5 mL 混溶有 0.5%SDS 的 PBS(pH7.4，取磷酸二氢钾 1.36 g，加 0.1 mol/L氢氧化钠溶液79 mL，用水稀释至200 mL，即得)，形成药物和纳米粒混悬液，再放入透析袋(MWCO3500)中，置25 mL PBS 37℃120 r/min摇床中，于0.25、1、2、3、4、5、7、9、12、15、18、21、24、27、30 d精取透析液20 mL(同时加入PBS 20 mL)，减压蒸干，残留物用10 mL流动相溶解后16 000 r/min离心10 min，取上清液按1.2.2色谱条件测定CM含量，根据标准曲线方程，计算其浓度和累积释放量，并用SPSS 13.0统计软件，多组资料采用方差分析，两组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 粒径及zeta电位

结果CPTN平均粒径为(197.9±6.2)nm(n=3)，Zeta电位为(-22.3 ±1.8)mV(n=3)，多分散系数(polydispersity index，PDI)=0.076。

2.2 载药量和包封率的测定

结果根据标准曲线方程计算样品CPTN的载药量为(13.2 ±0.9)%(n=5)、包封率为(79.3 ±1.6)%(n=5)。

2.3 姜黄素释放度的测定

取6次试验的平均累积释放率对时间作图，绘制释放曲线，结果见图3，与CM原料药相比，两种CM纳米粒具有显著的缓释作用。

图3 两种纳米粒中CM和CM原料药在PBS(pH7.4)中的累积释放率曲线(n=6)Fig 3 Cumulative release rate in PBS(pH7.4)of CPTN，CPN and CM raw drug(n=6)

3 讨论

CPTN和CPN的体外释放均呈两相释放，前9 d药物累积释放率分别为66.2%和79.3%，属于快速释放;9 d后释药保持稳定增长，30 d时累积释放率分别达到80.7%和91.3%，药物为缓慢恒速释放。1 d时为突释阶段，两种纳米粒的释药量不超过30%;扩散阶段纳米粒释药持续时间最长，释药稳定增长，累积释药超过40%;降解阶段纳米粒中载体材料降解，释药达到80%以上，表明纳米粒具有一定的缓释作用。自制的载体材料PLGA-TPGS制备的姜黄素纳米粒CPTN，具有比市售材料PLGA制备的CPN更大的体外累积释放率，这为进行体内纳米粒的吸收、分布、肝脏靶向性评价等试验奠定了基础。

纳米粒经静脉注射后，在体内的分布首先取决于纳米粒的粒径大小。通常50～100 nm的微粒系统可以进入肝实质细胞中;粒径为100～200 nm的微粒很快被网状内皮系统(RES)的巨噬细胞从血液中清除，最终到达肝枯否细胞(Kupffer cell)溶酶体中;200～400 nm的纳米粒集中于肝后迅速被肝清除。纳米粒的靶向性还与微粒的表面电荷和疏水性质有关，如表面带负电荷的微粒易被肝脏摄取。微粒的粒径及其表面的性质决定了吸附哪种调理素及其吸附程度，同时决定了吞噬的途径和机制［3］。本试验制备的CPTN平均粒径为197.9 nm，Zeta电位为-22.3 mV，同时由于TPGS具有肝细胞特异性识别的作用及载体所带电荷也为负性，更可提高纳米粒对肝脏的主动靶向作用，以使CM能更好地发挥其抗肝炎和抗肝癌等作用。与CM原料药相比，两种CM纳米粒具有显著的缓解作用。这是由于在CM纳米粒中，CM大量分布在两种材料形成的网状骨架中，药物的释放必须经过网状骨架结构往外扩散，故可延缓药物的释放。关于CPTN在体内对肝脏的主动靶向性等试验有待进一步的研究。

采用RP-HPLC测定纳米粒和体外释放介质中姜黄素的含量，操作简便，线性范围宽，重现性好，数据准确。姜黄素在水中的溶解度极小，选用0.5%SDS水溶液做释放介质，能有效增加姜黄素的溶解度，且载体材料和释放介质对姜黄素的测定均无干扰。

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Preparation and quality evaluation of Curcuminloaded PLGA-TPGS Nanoparticles

SUN Hui1，GAO Meng2，JIANG Ni3，BAO Xu2，LI Lei2，LI Zhen2，TIAN Yan2
(1.Department of Pharmaceutics，No.210Hospital Branch of CPLA，Dalian116001，China;2.College of Pharmacy，Dalian Medical University，Dalian116044，China;3.Department of Pharmaceutics，Dalian Children Hospital，Dalian116001，China)

［Abstract］ObjectiveTo prepare Curcumin-loaded polylactic-co-glycolic acid-D-α- tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate nanoparticles(CM -PLGA-TPGS-NPs，namely CPTN)and evaluate their quality.MethodsCPTN were prepared by ultrasonication emulsion/solvent evaporation technique using PLGA -TPGS made by ourselves，its mean size，Zeta potential，drug - loading，encapsulation efficiency andin vitrorelease rate of CPTN were determined.The condition was checked by RP -HPLC on KROM ASIL C18 column(4.6 mm ×250 mm，5 μm)with acetonitrile and 2%acetic acid(58∶42)as mobile phase，and the detective wavelength was 430 nm.ResultsCPTN was sphere-like with mean particle size of(197.9 ±6.2)nm，Zeta potential of(-22.3 ±1.8)mV，drug- loading of(13.2 ±0.9)%and encapsulation efficiency of(79.3 ± 1.6)%.Thein vitrodrug release profile in phosphate buffer solution of pH 7.4 containing 0.5%w/v Sodium dodecyl sulfate showed diphasic release pattern，the cumulative release rate was 91.3%at 30 d.ConclusionCPTN is stable and controllable in quality，in vitrorelease rate shows obvious sustained release.

［Key words］curcumin;PLGA -TPGS;nanoparticles;RP-HPLC;in vitrorelease rate

R965.3

A

1671-7295(2013)05-0438-04

孙辉，高萌，蒋妮，等.姜黄素PLGA-TPGS纳米粒的制备和质量评价［J］.大连医科大学学报，2013，35(5):438-441.

10.11724/jdmu.2013.05.07

孙 辉(1977-)，女，辽宁沈阳人，主管药师。E-mail:yyyyti@163.com

田 燕，教授。E-mail:tiany2004@126.com

2013-07-09;

2013-08-27)