Sorcin蛋白高表达与肺癌细胞株NCI-H446多药耐药的关系

王 涛，裴复阳，王 琪，王莺燕

(1.大连大学附属中山医院呼吸内科，辽宁 大连 116001;2.大连医科大学 附属第二医院 呼吸内科，辽宁 大连 116027;3.大连医科大学 诊断教研室，辽宁大连 116044)

Sorcin蛋白高表达与肺癌细胞株NCI-H446多药耐药的关系

王 涛1，裴复阳1，王 琪2，王莺燕3

(1.大连大学附属中山医院呼吸内科，辽宁 大连 116001;2.大连医科大学 附属第二医院 呼吸内科，辽宁 大连 116027;3.大连医科大学 诊断教研室，辽宁大连 116044)

目的 探讨Sorcin高表达与肺癌细胞NCI-H446多药耐药的相关性。方法 研究对象为肺癌细胞NCI-H446，以顺铂为诱导药物，建立多药耐药细胞系NCI-H446/CDDP;应用反义核酸技术抑制NCI-H446/CDDP细胞Sorcin的表达建立转染细胞，为反义核酸组，同时设空白对照组。通过RT-PCR及Western-blot分别检测各组细胞中Sorcin在核酸及蛋白水平的表达;MTT法测定NCI-H446组、反义核酸组、NCI-H446/CDDP组3组细胞在不同化疗药物DDP、VCR、ADM、VP-16作用下生存率;用Pearson相关分析Sorcin高表达与肺癌细胞株NCI-H446多药耐药的相关性。结果 各组细胞中Sorcin在核酸及蛋白水平的表达，NCI-H446/CDDP组与空白对照组比较，差异无显著性意义(P＞0.05)，NCI-H446组、反义核酸组、NCI-H446/CDDP组各组间比较均具有显著性意义(P＜0.05);NCI-H446/CDDP细胞中Sorcin在核酸及蛋白水平均明显高于NCI-H446细胞，分别为NCI-H446细胞的9.81倍和7.67倍。各组细胞在不同化疗药物作用下IC50:NCI-H446/CDDP组＞反义核酸组＞NCI-H446组，各组间比较差异具有显著性意义(P＜0.05)。Pearson相关提示:Sorcin核酸及蛋白水平的表达与在不同化疗药物作用下各组细胞的IC50值呈负相关(P＜0.05)。结论 Sorcin蛋白的高表达与肺癌多药耐药相关，抑制Sorcin蛋白的表达可以逆转肺癌多药耐药性。

可溶性耐药相关钙结合蛋白;肺癌;多药耐药;耐药指数

肿瘤细胞的多药耐药性(multi-drug resistance，MDR)是指肿瘤细胞接触一种化疗药物并对其产生耐药后，同时对其他化学结构和作用机制不同的化疗药物亦产生耐药［1］。肺癌是全球性的恶性疾病，其发病及死亡率在世界范围的肿瘤性疾病中居首位，化疗是肺癌的主要治疗方法，但是肺癌对多种化疗药物产生耐药常常导致治疗失败［2］。肺癌耐药机制比较复杂，因此迫切需要探明耐药机制，通过各种途径逆转其耐药性。很多研究表明，可溶性耐药相关钙结合蛋白 (Sorcin)是一种胞浆蛋白，与肿瘤的多药耐药关系非常密切，目前对其研究主要集中在胃癌与血液系统肿瘤方面［3-4］，对其与肺癌多药耐药关系的研究颇少。本研究旨在通过RT-PCR及Western-blot分别检测NCI-H446细胞及多药耐药细胞NCI-H446/CDDP中Sorcin在核酸及蛋白水平的表达水平，观察应用反义核酸技术抑制NCI-H446/CDDP细胞Sorcin的表达后耐药情况的变化，探讨Sorcin在肺癌细胞多药耐药中的作用。

1 材料和方法

1.1 研究对象及试剂

人小细胞肺癌(SCLC)细胞株NCI-H446购于中科院上海细胞所细胞库。RPMI 1640培养基、优等胎牛血清和精制小牛血清(Hyclone产品);二甲基四氮唑兰(MTT)(Bebco公司产品);二甲基亚砜(DMSO)、DDP、5-FU、VCR、ADM 和 VP -16(Sigma公司产品);RT-PCR试剂盒、DNA Marker DL2000(Takara产品)，羊抗人Sorcin一抗抗体、羊抗人βactin抗体、HRP-兔抗羊IgG(Santa Cruz公司)。

1.2 方 法

1.2.1 多药耐药细胞系NCI-H446/CDDP的诱导建立:以人SCLC细胞株NCI-H446为诱导对象，顺铂为诱导药物，采用首次大剂量冲击和逐步增加剂量结合的方式，最终建立人SCLC多药耐药细胞系NCI-H446/CDDP。该耐药细胞系能在含有0.5 μg/mL顺铂的RPMI1640培养液中稳定生长和传代。

1.2.2 Sorcin 反义核苷酸转染 NCI- H446/CDDP细胞:采用Sorcin反义核苷酸(antisenseoligonucleotides，ASO)抑制Sorcin在NCI-H446/CDDP的表达。反义核酸序列参照文献［6］，反义核酸序列为5’-TACGCCATGCTGCAGACTGC-3’与 Sorcin翻译起始区互补。反义核酸序列经GenBank比对，与已知任何哺乳动物基因无匹配。硫代修饰的Sorcin反义核酸由TaKaRa公司合成。按脂质体转染试剂盒(Lipofectamine2000)说明转染反义核酸至 NCIH446/CDDP细胞。并设脂质体(oligofect-amine)为空白对照组。

1.2.3 细胞分组:将细胞分为4组:NCI-H446组、反义核酸组、空白对照组、NCI-H446/CDDP组。

1.2.4 RNA提取以及RT-PCR:按试剂盒说明分别提取各组细胞的总RNA，制备cDNA，进行PCR产物扩增。Sorcin引物由上海生工公司合成。引物设计参照文献［3］，上游引物:5’AAAAGATCTATGGCGTACCGGGGCAT 3’;下游引物:5’GGGTCTAGATTAAACA CTCATGACACATTG 3’;内参β-actin上游引物序列为5’CTACAATGAGCTGCGTGTGGC 3’，下游引物序列为 5’GAGGTCCAGACGCAGGATGGC 3’。取 PCR扩增产物10 μL，于1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，用美国UVP凝胶成像系统EC3System进行扫描分析，计算公式为:某样品Sorcin mRNA的相对表达水平=样品Sorcin的IOD值/样品β-actin的IOD值。

1.2.5 蛋白提取及Western杂交:将细胞置于1.5 mL Eppendorf管中，加入 RIPA 缓冲液 300 μL，以12 000 r/min速度、4℃离心10 min，将上清转移至新管，再重复离心2次，-70℃保存;使用Bradford比色法测定蛋白含量，依次进行SDS-PAGE、电转印。取下转印好的PVDF膜，放入封闭液中4℃封闭过夜，加入稀释的羊抗人Sorcin一抗抗体(一抗，1∶200)及羊抗人 β -actin(一抗，1∶400)，37℃孵育1 h，PBST洗膜3次，5 min/次。再加入稀释的辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG(二抗，1∶5 000)，37℃孵育1 h，PBST洗膜3次，5 min/次，在室温进行ECL显色。用美国UVP公司EC3 System凝胶成像系统对PVDF膜进行扫描分析，计算公式为:样品Sorcin蛋白的相对表达水平=样品Sorcin的IOD值/样品β-actin的IOD值。

1.2.6 体外药物敏感性实验:采用 MTT法检测NCI-H446组、反义核酸组、NCI-H446/CDDP组细胞对DDP、VCR、ADM和VP-16的药物敏感性。将细胞以1×105/mL的浓度接种于96孔培养板，200 μL/孔，培养24 h后加入生理盐水稀释的不同浓度的各种化疗药物，共同作用24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，再培养4 h后，离心去除培养液，每孔加入二甲基亚砜 150 μL，用震荡器震荡10 min，在全自动酶标仪上选择波长570 nm测定吸光值(A值)，比色时空白孔调零，全部实验重复3次，取平均值。根据A值计算细胞存活率(vitalrate，VR)，计算公式为:细胞存活率(%)=用药组A值/对照组A值×100%。根据各药物VR，由药物浓度的对数值与VR线性回归求出各药物的半数抑制率(IC50)。计算耐药指数(resistant index，RI)，RI=IC50实验组/IC50对照组［5］。

1.3 统计学方法

所有实验均重复3次以上，实验数据用MEAN±SD表示，采用 SPSS 12.0软件处理，用单向方差分析比较多组间均数的差异，用Pearson相关分析Sorcin高表达与肺癌细胞株NCI-H446多药耐药的相关性，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Sorcin核酸水平的表达

RT-PCR结果显示:各组细胞Sorcin mRNA的相对表达量如图1所示，NCI-H446组、反义核酸组、空白对照组和NCI-H446/CDDP组的 SorcinmRNA 表达水平分别为:0.094 ±0.001、0.441 ±0.031、0.814 ± 0.036 和 0.923 ± 0.012。NCI -H446/CDDP组与空白对照组比较，差异无显著性意义(P＞0.05);NCI-H446组、反义核酸组、NCIH446/CDDP组各组间比较差异均具有显著性意义(P＜0.05)。NCI-H446/CDDP组及反义核酸组分别为NCI-H446组的9.81倍及4.69倍。

2.2 Sorcin蛋白水平的表达

Western-blot结果显示如图2:与核酸表达一样，NCI-H446/CDDP组Sorcin蛋白的表达最高，反义核酸组次之，NCI-H446组最低，分别为:0.943±0.024、0.357 ±0.023、0.123 ±0.021，各组间比较差异有显著性意义(P＜0.05)。NCI-H446/CDDP组及反义核酸组分别为NCI-H446组的7.67倍及2.9倍。空白对照组Sorcin蛋白的表达为0.874±0.017与NCI-H446/CDDP组比较，差异无显著性意义(P ＞0.05)。

图1 不同组细胞Sorcin核酸水平的表达Fig 1 Expression of Sorcin mRNA in different cell group

图2 不同组细胞Sorcin蛋白水平的表达Fig 2 Expression of Sorcin protein in different cell group

2.3 各组细胞的药物敏感性测定

MTT法检测3组细胞:NCI-H446组、反义核酸组、NCI-H446/CDDP组在不同化疗药物DDP、5-FU、VCR、ADR和VP-16作用下的敏感性如表1。各组细胞IC50:NCI-H446/CDDP组＞反义核酸组＞NCI-H446组，各组间比较，差异均具有显著性意义(P ＜0.05)。

表1 3组细胞在不同化疗药作用下的IC50值Tab 1 The IC50of three cell group in different chemotherapy drugs

2.4 Pearson相关

Sorcin mRNA及蛋白表达与不同化疗药物作用下各组细胞的IC50值之间呈负相关(P＜0.05)，见表2。

表2 Sorcin mRNA及蛋白表达与在不同化疗药物作用下细胞IC50值之间的相关系数Tab 2 Correlation coefficient between the expression of sorcin in mRNA and protein in IC50of the group cells in different chemotherapy drugs

3 讨论

肺癌已经成为全世界最常见的恶性肿瘤，在恶性肿瘤相关死亡原因中占第1位。化疗是肺癌的主要治疗方法，但是由于肺癌对许多化疗药物产生耐药常常导致化疗失败。肺癌的耐药机制比较复杂，一般可分为内源性和获得性耐药。因此迫切需要探明肺癌耐药机制，通过各种途径逆转其耐药性。

肿瘤多药耐药(multidrug resistance，MDR)是指肿瘤细胞对某种化疗药物产生耐药性的同时，对其他结构上无关，作用靶点不同、作用机制亦各异的药物也产生交叉耐药性，这是一种独特的广谱耐药现象。近年来，MDR形成机制已成为国内外学者研究的热点之一。已经发现的耐药相关蛋白有P170糖蛋白、多药耐药相关蛋白、肺耐药蛋白、拓扑异构酶、蛋白激酶C、乳腺癌耐药相关蛋白及超氧化酶歧化酶等。但以往研究结果都不能完全解释肿瘤多药耐药现象［6］。因此，有必要采用新方法和技术开展肿瘤多药耐药性研究。

可溶性耐药相关钙结合蛋白(Sorcin)是一种胞浆蛋白，具有典型的“E-F hand”钙结合位点，广泛分布于正常组织，其中心肌组织含量最为丰富［7］。1981年Meyers等［8］首次从长春新碱诱导的中国仓鼠多药耐药细胞株DC-3F/VCRd-5中发现了这种高表达的胞浆蛋白(PI=5.7)。研究发现Sorcin能在50%以上多种药物筛选的多药耐药细胞中大量表达。Lee［9］建立了耐长春新碱(VCR)的淋巴瘤耐药株HOB1/VCR，Southern检测发现仅在高浓度的VCR作用下才有Sorcin基因的扩增，且Sorcin基因不随mdr1基因的扩增而扩增，故认为Sorcin基因的扩增和mRNA的表达是在高浓度VCR作用下产生的，其研究结果也提示Sorcin与mdr1相关性不高，很可能在多药耐药性产生中单独起作用。Parekh HK等［10］将Sorcin基因cDNA转染卵巢癌细胞株和乳腺癌细胞株，诱导出了对紫杉酚的低水平抗药性，虽然Sorcin基因的转染没有诱导出高水平的抗药性，但这是Sorcin参与多药耐药性形成的有力证据。Sorcin与肿瘤的多药耐药关系非常密切，目前主要集中在胃癌与血液系统肿瘤方面［2-3］，但是对Sorcin与肺癌多药耐药关系的研究颇少。本实验研究结果显示:NCI-H446/CDDP细胞Sorcin在核酸及蛋白水平的表达明显高于NCI-H446细胞，相应的NCI-H446/CDDP细胞对不同化疗药物的IC50值亦明显高于NCI-H446细胞;应用反义核酸技术抑制NCI-H446/CDDP细胞Sorcin的表达后细胞对不同化疗药物的IC50值降低;Pearson相关提示:Sorcin核酸及蛋白水平的表达与在不同化疗药物作用下各组细胞的IC50值呈负相关，表明Sorcin的表达与肺癌多药耐药有关，抑制其表达可望成为提高肺癌化疗效果的新手段。

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Relationship of Sorcin over-expression to multidrug resistance of human lung cancer cell line NCI-H446

WANG Tao1，PEI Fu -yang1，WANG Qi2，WANG Ying-yan3
(1.Department of Respiratory Medicine，Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University，Dalian116001，China;2.Department of Respiratory Medicine，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116027，China;3.Diagnostic Laboratory，Dalian Medical University，Dalian116044，China)

［Abstract］ObsjectiveTo investigate the relationship of the high expression of sorcin with multidrug resistance in lung cancer cell NCI-H446.MethodsLung cancer cell NCI-H446 was object of study，set up cell line NCI-H446/CDDP through cisplatin;Using antisense nucleic acid technology inhibited the expression of sorcin in NCI- H446/CDDP cell，building antisense nucleic acid group，at same time setting up blank control group.RT-PCR and Western-blot were used to analyze the expression of sorcin at mRNA and protein levels in every cell group.MTT was used to three groups cell(NCI-H446 cell group，antisense nucleic acid group，NCI-H446/CDDP group)survival rate in DDP，VCR，ADM，VP-16.Pearson correlation was used to analyze the correlation of the high expression of sorcin with multidrug resistance in lung cancer cell NCI-H446.ResultsComparison with the expression mRNA and protein of sorcin in every groups，the result showed:comparing NCI-H446/CDDP group with blank control group has no statistical significance(P＞0.05)，In-tercomparison in NCI-H446 cell group，antisense nucleic acid group，NCI-H446/CDDP group has statistical significance(P ＜0.05).The expression mRNA and protein of sorcin in NCI-H446/CDDP were obviously higher than it in NCIH446 cell，9.81 and 7.67 times respectively.The result of IC50:NCI- H446/CDDP group ＞ antisense nucleic acid group ＞ NCI-H446 cell group，has statistical significance(P ＜0.05).Pearson correlation to point out:the expression of sorcin in mRNA and protein was negatively correlated to IC50of the group cells in different chemotherapy drugs.ConclusionThe high expression of sorcin is related to multidrug resistance in lung cancer cell，Inhibition of its expression can reverse the drug resistance of lung cancer.

［Key words］soluble-resistance related calcium binding protein(sorcin);lung cancer;muit-drug resistance;resistance index

R734.2

A

1671-7295(2013)05-0420-04

王涛，裴复阳，王琪，等.Sorcin蛋白高表达与肺癌细胞株NCI-H446多药耐药的关系［J］.大连医科大学学报，2013，35(5):420 -423，433.

10.11724/jdmu.2013.05.03

国家自然科学基金项目(30670532，81071228)

王 涛(1970-)，女，山东德州人，主治医师，硕士研究生。E-mail:wangtao9879@hotmail.com

王 琪，教授，博士生导师。E-mail:wqdmu@yahoo.com.cn

2013-07-11;

2013-08-25)