大鼠乳腺增生病模型的建立

龙思敏，王 群，王小平，蔡惠群，王珊珊

(1.上海中医药大学2011级，上海 201203;2.上海中医药大学附属上海中医医院 外二科，上海 200071)

大鼠乳腺增生病模型的建立

龙思敏1，王 群2，王小平2，蔡惠群2，王珊珊2

(1.上海中医药大学2011级，上海 201203;2.上海中医药大学附属上海中医医院 外二科，上海 200071)

目的 建立大鼠乳腺增生疾病模型并观察其复旧情况。方法 选用SD雌性未孕大鼠，随机分为对照组和模型组，模型组使用肌肉注射苯甲酸雌二醇(剂量为0.5 mg/kg·d)及黄体酮(剂量为5 mg/kg·d)方法复制乳腺增生模型，造模成功后取下右侧乳房，再去除造模因素饲养28 d后取下左侧乳房，分别与对照组对应乳房进行比较，观测第三对乳头直径、腺泡、导管数量以及腺泡横径和导管内径。结果 模型组与对照组相比，乳头直径(pixel)、腺泡数量(个)、直径(pixel)、导管内径(pixel)均有增大(分别为:1.17 ±0.12 vs 0.93 ±0.097，23.75 ±5.30 vs 13.13 ±3.61，360.13 ±65.63 vs 162.50 ±33.68，236.63 ±68.28 vs 102.13 ±54.04，P均 ＜0.01);去造模因素组乳头直径(pixel)、腺泡数量(个)、横径(pixel)以及导管内径(pixel)均小于模型组，且差异有显著性意义(分别为0.96 ±0.10 vs 1.17 ±0.12，16.50 ±5.44 vs 23.75 ± 5.30，228.50 ± 44.10 vs 360.13 ±65.63 及 162.13 ± 73.40 vs 236.63±68.28，P均＜0.01)，各组间导管数量差异无显著性意义(P＞0.05)。结论 雌二醇、孕酮交替肌肉注射的方法可成功建立大鼠乳腺增生病模型，去除造模因素28 d后腺体复旧。SD大鼠乳腺增生病模型的稳定性有待进一步研究。

动物乳腺增生病;动物模型;雌激素

单纯的乳腺增生病是由于体内雌激素水平升高及乳腺组织所含的激素受体敏感性增高而导致的乳腺实质过度增生和退行不全。目前大鼠乳腺增生模型的建立方案较为成熟，以短期外源性雌、孕激素肌肉注射或去势造模为主［1］，但在用药剂量、用药时间上各有变化。本实验旨在建立乳腺增生病动物模型，并观察去除造模因素28 d后乳房外观和乳腺病理形态的变化。

1 材料和方法

1.1 实验动物

清洁级雌性SD大鼠16只，未孕，7～8周龄，体重(200±20)g，饲养温度22～26℃，湿度69%，自由饮水进食，动物及饲料均由中国科学院上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物许可证号SCXK(沪)2012-0002。将所有大鼠编号，用excel工具随机数功能进行随机分组，分为对照组8只，模型组8只。对照R组和模型组为模型建立后取材的右侧乳房，对照L组及去造模因素组为模型建立后去除造模因素饲养28 d后取材的左侧乳房。

1.2 实验药物及仪器

苯甲酸雌二醇注射液、黄体酮注射液(均由上海通用药业股份有限公司生产)，0.9%氯化钠注射液。双目显微镜(Leica DM 2500)，KD-BMⅡ电脑生物组织冷冻包埋机，KEDEE石蜡切片机(KD-1508，浙江金华市科迪仪器设备有限公司)，电热恒温水浴箱(型号H.H.S-T4，上海医疗器械五厂)。

1.3 造模方法

适应性饲养2周，体重达平均200 g后参考黄月玲等［2］的研究予模型组大鼠每日肌肉注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg，连续20 d，随后每日肌肉注射黄体酮5 mg/kg，连续5 d;对照组每日肌肉注射0.9%生理盐水 0.2 mL，连续 25 d。

1.4 取材与测量

用精密游标卡尺于造模前测量所有大鼠第三对乳头直径;造模结束后10%水合氯醛将所有大鼠麻醉，剔除胸腹部毛发，测量大鼠右侧第三只乳头直径，以乳头为中心，无菌状态下做一直径为1 cm的梭形切口将周围皮肤连同乳腺取下，切口缝合，取下乳房组织以10%甲醛溶液固定，术后大鼠苏醒;所有大鼠继续常规饲养28 d后脱椎处死，左侧第三只乳房、乳头测量及取材同上，乳房组织以梯度酒精、二甲苯脱水、包埋、切片、HE染色、封片，镜下分析乳腺形态。具体测量方法如下:显微镜下通过Leica Qwin v3拍照采图，在20倍物镜和10倍目镜下，每一标本取2张切片，每一切片选取一个观察指标相对密集的视野，将2个视野所显示的腺泡数量和导管数量进行计数，腺泡及导管直径通过Imagepro-Plus 6.0软件完成图像分析，均取其平均值，使用pixel作为长度单位。

1.5 统计学方法

应用SPSS18.0软件进行统计学处理，实验数据以均数±标准差(±s)表示，各组间乳头直径、腺泡横径比较采取单因素方差分析，腺泡数量、导管数量、导管内径等数据采用秩和检验，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状态

对照组大鼠安静，温顺;模型组大鼠烦躁喜叫，具有攻击性;模型组大鼠去除造模因素饲养28 d后警惕性强，易受惊。

2.2 乳头外观及直径

对照组大鼠乳头颜色与周围皮肤相近，柔软，扁平，贴服于皮肤，模型组大鼠乳头较对照组充血、肿大、竖立于皮肤表面，模型组去除造模因素饲养28 d后乳头颜色粉红，较贴服于皮肤;模型组乳头直径(1.17 ±0.12)pixel较对照R 组(0.93 ±0.097)pixel及去除造模因素组(0.96±0.10)pixel大，差异有显著性意义(P ＜0.01)，对照 L 组(1.01±0.16)pixel与去除造模因素组差异无显著性意义(P＞0.05)。

2.3 乳腺组织形态学观察

根据乳腺增生病理类型［3-4］镜下观察，对照组大鼠乳腺呈静息状态，腺泡形态及管腔结构正常，数量少，分布稀疏，内不含或少部分含微量嗜酸性分泌物，周围纤维及脂肪组织占较大比例，且形态未见明显异常(图1)。模型组大鼠乳腺腺泡与对照R组相比数量增多，横径增大(图2)，小叶内腺泡导管化并扩张，形成微小囊肿(图3)，大导管腔内见脱落的上皮细胞或大量嗜酸性分泌物(图4)，且大导管上皮可呈假复层样增生，管壁皱褶(图5)。去除造模因素组的乳腺与造模组相比腺泡数量减少，横径缩小、导管内径缩小(图6)，差异有显著性意义(P＜0.05)，但与对照L组相比又表现为腺泡数量增多，腺泡横径及导管内径的增大(P＜0.05)。几个比较组间导管数量比较，差异均无显著性意义(P＞0.05)。见表1。

图1 腺泡形态及管腔结构正常(对照组HE×100)Fig 1 Normal structure of acini and ducts(Control group HE×100)

图2 增生，腺泡数量增多，体积增大(模型组HE ×100)Fig 2 The number of acini increased(Model group HE×100)

图3 腺泡导管化，形成微小囊肿(模型组HE×100)Fig 3 Cystic hyperplasia(Model group HE×100)

图4 导管内嗜酸性分泌物增多(模型组HE×100)Fig 4 Pink secretion in ducts(Model group HE×100)

图5 导管上皮假复层样增生(模型组HE×100)Fig 5 The proliferation of ductal epithelium(Model group HE×100)

图6 腺泡缩小，结构轻度不良(去造模因素组HE×100)Fig 6 Approximate normal breast structure(Remove the factors group HE×100)

表1 各组大鼠平均腺泡、导管数量，腺泡、导管平均直径比较Tab 1 The quantity and diameter of acinar lumina and duct of mammary gland in groupsn

3 讨论

乳腺增生病与月经周期性激素水平变化相关，虽然目前的研究表明乳腺增生与诸多因素有关，如ER、PR受体的表达增强等［5］，但可以确定的是，机体内蓄积的雌、孕激素浓度超过正常水平，是刺激乳腺组织细胞不断增殖，造成乳腺结构紊乱的必要因素。本实验以大鼠为模型动物，使用雌二醇与孕酮为诱导物刺激导管、腺泡及其上皮细胞增生，发现镜下乳腺组织腺泡数量增多、腺泡体积增大，导管扩张、上皮细胞增殖、囊性增生或各种增生形态同时存在，证明了增加外源性雌孕激素可致大鼠乳腺增生，成功复制了乳腺增生病大鼠模型。但与黄月玲等［2］、饶金才等［6］报道模型建立后去除造模因素一段时间后成模率仍旧100%的结果不一致的是，本次实验采取同组大鼠在模型建立后即刻取下的右侧乳房与去除造模因素后饲养28 d取下的左侧乳房相比较，出现了乳头直径、镜下腺泡数量及腺泡横径的显著差异:与增生乳腺相比较，去除造模因素后的乳腺形态的变化是腺泡数量减少、腺泡横径和导管内径的缩小，差异有显著性意义;但与静止期乳腺相比较，去除造模因素的乳腺腺泡数量有所增加，腺泡横径和导管内径相较于静止期状态也有明显差异，说明外源性雌孕激素的作用可使乳腺呈增生状态，且腺泡数量不可逆地增加，而外源性雌激素的撤退可使原增生增大的腺泡及扩张的导管有一定程度的缩小，但无法恢复到静止期乳腺的状态;同时也在本次实验中发现各组间大导管的数量没有变化。与以上文献结果不一致的原因可能由于观察指标的着重点不同，前者注重于判断模型是否增生，而本次实验着重于根据乳腺被雌激素刺激和失去刺激所产生的不同反应，观察乳腺组织的动态变化。

动物模型建立的最终目的是为药物筛选提供载体，由于乳腺增生病大鼠模型的建立依托于增加外源性激素，一旦去除造模因素，实验动物可能会因为外源性激素的逐步消退而自身调节使激素代谢到达平衡状态，从而降低乳腺组织的增生程度，即出现不同程度的复旧。目前的大多数动物实验为了研究药物对乳腺增生病的治疗作用，在模型建立后撤除外源性激素，然后对模型进行治疗干预，观察时点一般在干预30 d左右，可能忽视了动物自身对疾病的调节能力，模糊了药物干预对模型动物疾病的转归程度的判定。现在也有一些研究在造模的同时进行药物干预［7-8］，可能会避免模型的复旧对药物干预结果的干扰，但是造模同时进行药物干预，更侧重的是预防，而不是治疗。在对模型的评价或疗效评价方面，多数实验只对增生发生率，或增生程度，如轻度增生、重度增生出现率之间的比较［9］，针对腺体形态进行量化评估和动态监测的观察方法［10］相对较少，本次实验着重于观察大鼠乳腺腺泡、导管数量和直径在静止期、增生期以及去除造模因素后的动态变化，其结果提示在药物治疗干预的实验研究中，需要考虑是否需要维持外源性雌激素的持续刺激避免模型的自然复旧，以确保对药物疗效的观察。在后续研究中本研究组将改进模型建立方法，并增加生化指标进行机制的探讨。

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Establishment in rat cyclomastopathy

LONG Si- min1，WANG Qun2，WANG Xiao - ping2，CAI Hui- qun2，WANG Shan - shan2
(1.Grade2011，Shanghai University of Chinese Medicine，Shanghai201203，China;2.Department of Surgery，Shanghai Traditional Chinese Medicine Hospital，Shanghai200071，China)

［Abstract］ObjectiveTo establish the model of hyperplasia of mammary gland in rat and observe the redintegration of the breast.MethodsSD female non-pregnant rats were randomized into 2 groups:normal group and model group.Model group received muscular injection of(0.5 mg/kg·d)and progesterone(5 mg/kg·d)to induce hyperplasia of mammary glands.After the modeling，right breasts taken from all of rats，then the opposite breasts would be taken after 28 days with conventional feeding，both breasts of model group compared with the control group respectively by diameter of the third nipples，the quantity and diameter of acinar lumina and duct of mammary gland.ResultsCompare with control group，the diameter of the nipple，the quantity and diameter of acinar lumina and ducts of mammary gland in model group increased significantly(diameter of the nipple:1.17 ±0.12 vs 0.93 ±0.097，the quantity of acinar lumina:23.75 ±5.30 vs 13.13 ±3.61，the diameter of acinar lumina:360.13 ± 65.63 vs 162.50 ± 33.68，the diameter of duct:236.63 ± 68.28 vs 102.13 ±54.04.P＜0.01)，but compare with the model group，they reduce in remove the factors group(diameter of the nipple:0.96 ±0.10 vs 1.17 ±0.12;the quantity of acinar lumina:16.50 ±5.44 vs 23.75 ±5.30;the diameter of acinar lumina:228.50 ±44.10 vs 360.13 ±65.63;the diameter of duct:162.13 ±73.40 vs 236.63 ±68.28，P＜0.01)，there was no significant difference in quantity of ducts among groups(P＞0.05).ConclusionA great quantity of ectogenic estradiol can induce mammoplasia，but without exogenous estrogen the model will be redintegrated after 28 days.

［Key words］animal mammary gland;animal model;estrogen

R285.5

A

1671-7295(2013)05-0434-04

龙思敏，王群，王小平，等.大鼠乳腺增生病模型的建立［J］.大连医科大学学报，2013，35(5):434-437.

10.11724/jdmu.2013.05.06

上海市中医临床优势专科(专病)第三批建设项目(ZYSNXD-YL-YSZK010)

龙思敏(1988-)，女，广西柳州人，硕士研究生。E-mail:83289953@qq.com

王 群，副主任医师。E-mail:dinolancet@gmail.com

2013-06-18;

2013-09-02)