糖尿病小鼠肝脏脂肪酸合成酶的动态表达

王 冰，程丽静，刘明川，高政南

(1.大连市中心医院内分泌科，辽宁大连 116033;2.大连医科大学附属第二医院泌尿内科，辽宁大连 116027;3.大连医科大学研究生院，辽宁大连 116044)

糖尿病小鼠肝脏脂肪酸合成酶的动态表达

王 冰1，程丽静2，刘明川3，高政南1

(1.大连市中心医院内分泌科，辽宁大连 116033;2.大连医科大学附属第二医院泌尿内科，辽宁大连 116027;3.大连医科大学研究生院，辽宁大连 116044)

目的 观察1型、2型糖尿病小鼠肝脏脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)表达的改变，探讨其在糖尿病肝脏脂质代谢紊乱中的意义。方法 1型糖尿病小鼠模型以链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导，对照组小鼠应用等量生理盐水。2型糖尿病小鼠模型选取C57BL/6基因背景下瘦素受体基因缺陷小鼠，纯合子db/db小鼠入选实验组;杂合子db/m小鼠入选对照组。应用免疫组化法检测FAS在肝脏定位;应用Real-time PCR技术、Western印迹方法，分别从mRNA水平、蛋白水平检测FAS在1型、2型糖尿病小鼠肝脏表达的变化。结果 FAS蛋白在肝脏广泛表达，主要位于肝细胞的胞浆内。1型糖尿病小鼠HbA1c水平(5.45±0.56)%明显高于对照组(2.93±0.08)%(P＜0.05)，血甘油三酯(triglyceride，TG)水平(2.25 ±0.66)mmol/L 高于对照组(0.99 ±0.46)mmol/L(P＜0.05)，血胆固醇(cholesterin，CHO)水平(1.90 ±0.12)mmol/L 高于对照组(1.62 ±0.10)mmol/L(P＜0.05);FAS的mRNA水平约为对照组的1.4倍，FAS在蛋白水平也明显高于对照组。2型糖尿病小鼠HbA1c水平(5.73±0.33)%明显高于对照组(3.90 ±0.07)%(P＜0.05)，db/db鼠也存在明显高脂血症，血 TG 水平(2.85 ±0.24)mmol/L高于对照组(0.87 ±0.40)mmol/L(P＜0.05)，血 CHO 水平(3.60 ±0.98)mmol/L 高于对照组(1.73±0.50)mmol/L(P＜0.05);FAS mRNA水平约为对照组的2.7倍，蛋白印迹显示db/db鼠肝脏FAS也明显高于db/m鼠。结论 1型、2型糖尿病小鼠均存在不同程度的脂质代谢紊乱，其肝脏FAS的含量，无论从mRNA水平还是蛋白水平均较正常小鼠明显增高。

糖尿病;脂代谢紊乱;脂肪酸合成酶

脂肪肝是糖尿病常见的并发症，有多种因素能够促进糖尿病患者脂肪肝的发生和发展，其中肝脏脂质代谢异常是其发生的重要原因之一。FAS是内源性脂肪酸合成的关键酶，含有脂肪酸合成所需的全部酶活性，在糖尿病患者脂肪肝的发病过程中可能具有重要作用。本研究旨在探讨FAS在糖尿病小鼠肝脏表达的改变及其可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

1型糖尿病小鼠模型:选取7周龄、18～20 g、雄性、C57BL/6小鼠，应用STZ 50 mg/kg腹腔注射，1次/d，连续5 d，再观察5 d，若小鼠出现明显糖尿病症状:多饮、多尿、多食、体重减轻，空腹血糖＞16.4 mmol/L入选实验组;同类小鼠应用等量生理盐水(NS)腹腔注射相同时间入选对照组，每组5只小鼠。

2型糖尿病小鼠模型:16周龄、雄性、C57BL/6背景下瘦素受体基因缺陷小鼠，实验组为纯合子db/db小鼠;对照组为杂合子db/m小鼠。每组5只小鼠。

小鼠在处死之前禁食6 h，处死前称重，将小鼠麻醉后，取心脏血，送检糖化血红蛋白(HbA1c)和血脂水平。

1.2 主要药品试剂

STZ购自北京天来生物医学科技有限公司;免疫组织化学试剂盒购自北京中山生物制剂公司;PCR引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成;兔来源FAS多克隆抗体购自美国Santa Cruz。

1.3 实验方法

免疫组织化学染色:正常小鼠肝脏组织石蜡切片依次经过脱蜡、水化、封闭内源性过氧化物酶、滴加兔来源FAS多克隆抗体(浓度为1∶100)37℃孵育1 h、滴加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(浓度为1∶500)、DAB显色等步骤。分别以封闭液作阴性对照，以脂肪组织染色作阳性对照。

Real-time PCR:定量检测FAS的mRNA水平。参照RNA trip说明书提取肝组织总RNA，逆转录成cDNA模板后进行PCR扩增。β-actin为内参，SYBR Green作检测染料，设对照组相对表达量为100%，计算目标基因相对表达量的变化。

引物序列:

小鼠 FAS(132 bp)上游:5’-AGGGGTCGACCTGGTCCTCA -3’，下游:5’-GCCATGCCCAGA -GGGTGGTT -3’;

β-actin(293 bp)上游:5’-ATCTGGCACCACACCTTC-3’，下游:5’-AGCCAGGTCCAGACG -CA -3’。

小鼠FAS的PCR反应条件为:94℃预变性5 min，94 ℃，30 s;63 ℃，30 s;72 ℃，30 s，共 35 个循环，最后72℃，7 min总延伸。

Western印迹法:采用常规方法提取小鼠肝脏总蛋白并定量，取100 μg进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后封闭1 h，加兔来源FAS多克隆抗体(1∶500)室温孵育1 h，洗膜后加羊抗兔IgG(1∶5000)室温孵育1 h，洗膜后进行化学法发光。

1.4 统计学方法

应用软件SPSS 13.0，采用独立样本t检验比较均数间的差异，单因素随机组方差分析进行组间的均数比较，以P＜0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 FAS蛋白在正常小鼠肝脏的分布

免疫组化结果显示，C57BL/6小鼠肝脏细胞胞浆显色为黄色，中央静脉周围及汇管区呈棕黄色，FAS蛋白在肝脏广泛表达，主要位于肝细胞的胞浆内，在中央静脉周围及汇管区等血运丰富的区域表达更为明显，见图1。

2.2 1型糖尿病小鼠HbA1c、TG和CHO水平

1型糖尿病小鼠HbA1c、TG和CHO水平，均显著高于对照组(P＜0.05)，见表1。

图1 正常小鼠肝脏上FAS蛋白的表达Fig 1 FAS protein expression in the mouse liver

表1 1型糖尿病小鼠与对照组HbA1c、TG和CHO水平Tab 1 Comparison of HbA1c、TG and CHO between type 1 diabetes mouse and control group

2.3 1型糖尿病小鼠肝脏FAS的mRNA水平

1型糖尿病小鼠肝脏FAS的mRNA水平较对照组明显增加，约为对照组的1.4倍(P＜0.05)。

2.4 1型糖尿病小鼠肝脏FAS的蛋白水平

在蛋白水平，1型糖尿病小鼠肝脏FAS的蛋白含量明显高于对照组小鼠(图2)。

2.5 2型糖尿病小鼠HbA1c、TG和CHO水平

2型糖尿病小鼠HbA1c、血TG和血CHO水平均高于对照组(P＜0.05)，见表2。

图2 1型糖尿病小鼠肝脏FAS蛋白含量Fig 2 The protein level of FAS in liver of type 1 diabetes mouse

表2 2型糖尿病小鼠与对照组HbA1c、TG和CHO水平Tab 2 Comparison of HbA1c、TG and CHO between type 2 diabetes mouse and control group

2.6 2型糖尿病小鼠肝脏FAS的mRNA水平

2型糖尿病db/db鼠肝脏FAS mRNA水平较对照组 db/m鼠明显上调，约为对照组的 2.7倍(P ＜0.05)。

2.7 2型糖尿病小鼠肝脏FAS的蛋白水平

在蛋白水平，db/db鼠肝脏FAS的蛋白含量也明显高于对照db/m鼠(图3)。

图3 2型糖尿病小鼠肝脏FAS蛋白含量Fig 3 The protein level of FAS in liver of type 2 diabetes mouse

3 讨 论

随着人们生活水平的提高和生活方式的改变，糖尿病已成为中国继心脑血管疾病和肿瘤之后的第三大疾病。脂质代谢异常是糖尿病，特别是2型糖尿病的重要慢性并发症。众所周知，肝脏在脂类的消化、吸收、合成、分解及运输中发挥着重要作用，甘油三酯在肝脏合成过多和/或分解障碍，均能使血浆甘油三酯升高，高甘油三酯血症作为危险因子，与脂肪肝的发生关系密切。

FAS是催化乙酰辅酶A、丙二酸单酰辅酶A和NADPH合成饱和长链脂肪酸的关键酶［1-4］。它能催化1个分子的乙酰辅酶A和7个分子的丙二酸单酰辅酶A，经转酰、缩合、还原、脱水和再还原的7次重复过程合成脂肪酸，而脂肪酸是合成甘油三酯的重要原料。糖尿病的脂质代谢紊乱很可能与肝脏FAS表达的变化有关。

此次研究结果显示，FAS蛋白在C57BL/6小鼠肝脏上广泛表达，主要表达于肝细胞胞浆内，在中央静脉周围和汇管区肝细胞表达量较其他部位稍高，这可能与这些部位血运丰富和代谢旺盛有关。FAS蛋白在肝脏有广泛表达，为进一步研究提供了先决条件。本实验分别选择用1型和2型糖尿病小鼠模型观察FAS在糖尿病小鼠肝脏上表达的改变。多次、小剂量STZ诱导的糖尿病模型具有高血糖、体重减轻、多饮多食多尿的特点，与临床1型糖尿病吻合，为经典的1型糖尿病小鼠模型构建方法。C57BL/6背景下瘦素受体基因缺陷的db/db小鼠是一种遗传性肥胖型2型糖尿病模型，具有高血糖、高胰岛素血症、高甘油三酯血症和胰岛素抵抗等特征，是研究2型糖尿病的理想模型。研究表明:1型糖尿病小鼠和2型糖尿病小鼠均存在不同程度的血脂异常，即高胆固醇血症及高甘油三酯血症，此与糖尿病患者的临床特点相吻合，说明本实验所选用的两种小鼠模型极具代表性。本次研究发现，与对照组小鼠相比，1型糖尿病小鼠肝脏上的FAS含量，无论mRNA水平，还是蛋白水平，与对照组比较均明显增高。在2型糖尿病模型中也有类似发现，与对照的db/m小鼠相比，db/db小鼠肝脏呈脂肪肝表现，其FAS在mRNA水平和蛋白水平表达量均明显增高。由此推测，糖尿病状态下，小鼠肝脏FAS的高表达可能与糖尿病高糖状态下肝脏脂质代谢紊乱有关。高血糖状态下，肝脏的FAS表达量上调，因而导致肝脏甘油三酯的合成增多，从而导致脂肪肝形成。究其FAS高表达的原因，可能与调节脂质代谢的相关调控基因的表达改变有关。

固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)是脂质稳态的主要转录调节因子［5-6］，可激活脂肪酸合成所需的所有基因，其蛋白水平的增加，可直接激活多个参与脂肪酸合成的酶，包括 FAS［7-8］、硬脂酰辅酶 A去饱和酶(SCD-1)［9］和乙酰辅酶 A羧化酶(ACC)［10］等。碳水化合物反应元件结合蛋白(carbohydrate responsive element binding protein，ChREBP)是新发现的脂质调控的重要基因［11-12］。分析FAS的启动子区可发现固醇调节元件(SRE)、碳水化合物反应元件(ChRE)，由此可见，FAS是SREBP-1c和ChREBP两种重要脂质调控基因的靶基因，可在转录水平受到他们的调节。已有研究证实，db/db小鼠肝脏上的 SREBP-1c和 ChREBP，无论是在mRNA水平，还是在蛋白水平，均有明显增加。因此有理由推测，糖尿病状态下肝脏FAS表达的增加，可能是受到SREBP-1c和ChREBP的双重调控作用。

总之，本研究通过对糖尿病小鼠肝脏FAS表达的研究，探讨了糖尿病脂质代谢紊乱的可能机制。FAS表达异常可能是糖尿病肝脏脂质生成的重要原因，从而为进一步研究糖尿病时脂质代谢紊乱的原因提供实验依据。

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Dynamic expression of fatty acid synthase in the liver of diabetic mouse

WANG Bing1，CHENG Li-jing2，LIU Ming-chuan3，GAO Zheng-nan1
(1.Department of Endocrine，Dalian Municipal Central Hospital，Dalian116033，China;2.Department of Nephrology，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116027，China;3.Graduate School，Dalian Medical University，Dalian116044，China)

［Abstract］ObjectiveTo investigate the expression of fatty acid synthase in the liver of type 1 and type 2 diabetic mouse.MethodsType 1 diabetes mouse model induced by Streptozotocin and mouse in control group were given the same volume of NS.Leptin receptor-deficient(db/db)mouse on C57BL/6 background were used as type 2 diabetic mouse model and db/m were used as control.Immunostaining was used to detect the FAS protein expression in the liver.Real- time PCR and Western blot were used to detect the expression of FAS in the liver of diabetic mouse on mRNA and protein level.ResultsFAS was abundantly expressed in liver，especially in cytoplasm of liver cells.Compared with the control group，type 1 diabetic mouse showed higher level of HbA1c，TG and CHO.The HbA1c levels were higher than that in control group(5.45 ±0.56)%vs(2.93 ±0.08)%;The serum TG levels were higher than that in control group(2.25 ±0.66)mmol/L vs(0.99 ± 0.46)mmol/L.The serum CHO levels were higher than that in control group(1.90 ± 0.12)mmol/L vs(1.62 ±0.10)mmol/L.The mRNA level of FAS in the liver of type 1 diabetic mouse was dramatic higher than control group，increased about 1.4 times.At the protein level，FAS in liver of type 1 diabetic mouse was increased compared with the control.Similarly with type 1 diabetic mouse，type 2 diabetic mouse showed higher level of HbA1c and dramatic hyperlipemia.The HbA1c levels were higher than that in control group(5.73 ±0.33)%vs(3.90 ±0.07)%;The serum TG levels were higher than that in control group(2.85 ±0.24)mmol/L vs(0.87 ±0.40)mmol/L.The serum CHO levels were higher than that in control group(3.60 ±0.98)mmol/L vs(1.73 ±0.50)mmol/L.FAS in liver of db/db mouse was induced about 2.7 times as much as that of db/m mouse at the mRNA level.At the protein level，FAS in liver of db/db mouse was increased compared with the control.ConclusionThere existed dyslipidemia in diabetic mouse including Type 1 and Type 2，Liver expression of FAS was increase in Type 1 and Type 2 diabetic mouse were increased control with control.

［Key words］diabetes;dyslipidemia;fatty acid synthase

R589.2

A

1671-7295(2013)02-0130-05

王冰，程丽静，刘明川，等.糖尿病小鼠肝脏脂肪酸合成酶的动态表达［J］.大连医科大学学报，2013，35(2):130-134.

10.11724/jdmu.2013.02.08

王 冰(1981-)，女，辽宁锦州人，主治医师，硕士。E-mail:wangbing_1999_1981@163.com

高政南，主任医师。E-mail:gao2008@163.com

2012-11-22;

2013-02-28)