大肠埃希菌系统发育群基因检测与耐药率的研究

李瑞华，曲 杰，王 宁

(1.大连医科大学 附属第二医院 检验科，辽宁 大连 116027；2.大连医科大学 检验医学院，辽宁 大连 116044)

医学检验

大肠埃希菌系统发育群基因检测与耐药率的研究

李瑞华1，曲 杰1，王 宁2

(1.大连医科大学 附属第二医院 检验科，辽宁 大连 116027；2.大连医科大学 检验医学院，辽宁 大连 116044)

目的通过检测大肠埃希菌系统发育群基因及细菌耐药率，探讨两者间的关系。方法筛选ESBLs阳性菌株88例，通过多重PCR方法检测ChuA, YjaA 和 TspE4.C2基因；应用Vitek2 compact细菌自动鉴定及药敏分析仪检测细菌耐药率。结果大肠埃希菌系统发育群以D群57.95%为主，其余依次为A群20.45%、B2群14.78%、B1群6.82%。其中在痰标本中检出率A群、D群比例基本相当，但在其他标本中均以D群为主。B2群耐药率显著高于A群、D群(除外LEV)分离的菌株(P<0.05)。结论根据系统发育群基因检测，大肠埃希菌主要为D群为主，其次分别为A、B2、B1群。不同的系统发育群所表现的耐药性不同，其中毒力最强的B2群耐药率最高。

大肠埃希菌；系统发育群； ChuA；YjaA；TspE4.C2

大肠埃希菌是临床常见的条件致病菌，也是医院感染常见的病原菌。随着抗生素的广泛使用，大肠埃希菌的耐药问题更加严峻。其中产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)成为最常见的耐药机制，其可在不同菌群、菌株之间水平传递，常引起院内感染的暴发流行[1]。因此，对于ESBLs阳性菌耐药性的深入研究对指导临床用药十分重要。大肠埃希菌根据其系统发育群的研究，可分为A、B1、B2、D 4群[2]。不同的系统发育群所表现的致病能力也不同，其中，毒力最强的是B2群，其次是D群[3]。本研究对临床分离出来的88例ESBLs阳性的大肠埃希菌进行系统发育群和耐药率的检测，以了解其耐药性与发育群的关系。

1 资料与方法

1.1 标本来源

收集2012年4月—12月大连医科大学附属第二医院临床分离出的88株ESBLs阳性大肠埃希菌，剔除重复菌株。标本来自患者痰液(13株)，尿液(35株)，血液(18株)，胸、腹水(3株)，脓汁(6株)，胆汁(7株)，分泌物(2株)，穿刺液(4株)等。标准质控菌株：阴沟肠杆菌ATCC700323;大肠埃希菌ATCC25922。

1.2 主要仪器及试剂

细菌鉴定和药敏试验判定由VITEK 2 compact 型全自动细菌鉴定药敏分析系统完成，药敏折点使用CLSI 2012年判定标准。引物由大连宝生物工程有限公司合成；PCR反应由天根生化科技有限公司研制的一管便携式PCRMastermix完成。

1.3 DNA的提取

煮沸法提取细菌DNA做为模板。

1.4 多重PCR扩增

用多重PCR法检测88株细菌中的系统发育群基因，引物设计及产物判断参见文献[2]，所用引物见表1。

表1 ChuA、YjaA、TspE4.C2基因的引物

PCR检测发育群基因反应体系：反应体系共25 μL。反应液12.5 μL,每条引物各1 μL，模板2 μL。反应条件：预变性94℃×5 min; 共30个循环:94℃×30 s，55℃×30 s，72℃×30 s，最后延伸72℃×7 min。

PCR产物电泳： 2%琼脂糖50 mL+1 μL溴化乙锭，100 V，稳压电泳20～30 min，最后在凝胶成像系统上拍照阅读结果。

1.5 统计学方法

应用SPSS11.5统计软件进行分析，两组率的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PCR产物电泳凝胶成像结果

PCR产物经电泳凝胶成像，其中ChuA在279 bp，YjaA在211 bp，TspE4.C2在152 bp处出现清晰条带。通过对基因条带的分析来确定属于A群、D群、B2群、B1群。见图1。

2.2 大肠埃希菌检测系统发育群结果

比例最大的是D群为57.95%，其余依次为A群(20.45%)、B2群(14.78%)、B1群(6.82%)。通过分析大肠埃希菌主要来源可以看出，在痰标本中A群、D群相等，其余标本中均以D群为主。见表2。

图1部分携带ChuA、YjaA、TspE4.C2基因菌株PCR产物电泳结果

Fig 1 Partial electrophoretic result of ChuA, YjaA and TspE4.C2

1为A群；2,3,6为D群；5为B2群；7为B1群；4为Marker

M：DL2000TM,DNA Marker 1：groupA；2,3,6：groupD；5：groupB2；7：group B1

2.3 系统发育群与常用抗生素耐药率关系

大肠埃希菌ESBL阳性株对亚胺培南、美罗培南的耐药率为零；对哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、呋喃妥因的耐药率较低；但是，对头孢呋辛、头孢曲松、环丙沙星、左氧氟沙星的耐药率达到了85%以上。

其中属于B2群的大肠埃希菌对于左氧氟沙星、环丙沙星、阿米卡星、头孢他啶的耐药率显著高于A群、D群(除外LEV)分离的菌株，差异有显著性意义(P<0.05)。见表3。

表2 大肠埃希菌按主要来源系统发育群比例

表3 系统发育群与药物耐药率比较

1)与A群、D群耐药率比较，P<0.05

CAZ：头孢他啶；TZP:哌拉西林/他唑巴坦；AK：阿米卡星；LEV：左氧氟沙星；F：呋喃妥因；CIP：环丙沙星

3 讨 论

大肠埃希菌根据其系统发育群可以分为A、B1、B2、D 4群。对于系统发育群的检测有以下几种方法，脉冲场凝胶电泳(PFGE)，随机扩增多态性DNA标记(RAPD)，多基因酶促电泳[4]等，但是这些方法费时又费力。后来，Clermont等[5]通过标记3个目的基因ChuA, YjaA 和 TspE4.C2，以简便的方法检测出系统发育群。ChuA肠出血性大肠埃希菌O157：H7中血红素运输所需的基因；YjaA是通过基因组序列在K-12大肠埃希菌中被确定的基因，其功能还不完全了解；TspE4.C2是消减文库中的匿名的DNA片段。本研究按照此种方法进行检测，选取3种目的基因以PCR方法对其进行扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳，分别在152 bp,211 bp,279 bp处呈现出3条清晰的条带，其中D群只在279 bp处出现1条条带，或伴152 bp处有条带；B2群会在279 bp,211 bp处出现两条条带，或伴152 bp处有条带；B1群在279 bp、211 bp处没有条带，在152 bp处有1条带；而A群在279 bp、152 bp、211 bp处均不会出现条带或仅在279 bp处有条带，这样就可以清晰地分析出各个系统发育群。

文献显示不同的地区各个系统发育群所占的比例可不同，Saira Bashir等[6]通过对巴基斯坦地区的研究指出所占比例最高的为B2群，其次为D群。黎晓强等[3]对广州地区系统发育群的研究表明D群为主要部分。本研究检测结果显示大肠埃希菌系统发育群以D群57.95%为主，其余依次为A群(20.45%)、B2群(14.78%)、B1群(6.82%)。通过对大肠埃希菌主要来源的分析可以发现，血、尿标本中都以D群为主，痰液标本中D群、A群比例相差不大，说明目前大连地区大肠埃希菌主要系统发育群可能以D群为主。

产ESBLs的大肠埃希菌在临床分离率达到60%～68.8%[7-8]，对于其耐药性的深入研究具有一定的代表性。本研究所选的大肠埃希菌为产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)阳性菌株，均对头孢曲松耐药，通过对其耐药性的研究发现，大部分抗生素的耐药率在50%以上，但对哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、亚胺培南和美罗培南高度敏感。故碳青霉烯类抗菌药物可作为首选的治疗药物，用于治疗重大感染；其次可以选用β-内酰胺酶抑制剂复合物及阿米卡星。但是阿米卡星具有一定的肾毒性，在用药时应注意。头孢替坦、头孢吡肟也有很好的治疗效果。其他类药物均呈现不同程度耐药，临床治疗时应避免使用。

不同的系统发育群所具有的毒力因子不同，有报道指出毒力最强的是B2群，可以检测出3个或以上毒力因子，其次是D群可以检测出2～3个毒力因子[3]。通过对系统发育群与耐药率关系的分析可以得出，对于左氧氟沙星、环丙沙星、阿米卡星、头孢他啶4种药物,B2群的耐药率显著高于A群、D群(除外LEV)(P<0.05)。可能与其检测出的毒力因子多于其他群有关。至于毒力因子与耐药性的关系有待进一步研究。因B1群数量较少，没有进行统计分析。另外此次试验由于菌株数量偏少，可能代表性不是很强，还需要试验进一步验证。

[1]方家敏,钮博,韩玮玮,等.大肠埃希菌耐药性的研究进展[J].实用医技杂志，2011,18(5)：498-500.

[2]Olivier Clermont, Stephane Bonacorsi,Edouard Bingen.Rapid and Simple Determination of the Escherichia coli Phylogenetic Group[J].Applied and Environmental Microbiology,2000,66(10):4555-4558.

[3]黎晓强,卓超,廖东江,等.广州地区产CTX-M-15的大肠埃希菌的系统发育群的研究[J].中华检验医学杂志, 2010，2：152-154.

[4]Moreno E,Prats G,Sabaté M,et al.Quinolone, fluoroquinolone and trimethoprim sulfamethoxazole resistance in relation to virulence determinants and phylogenetic background among uropathogenic Escherichia coli[J].J Antimicrob Chemother,2006, 57:204-211.

[5]Clermont O, Bonacorsi S, Bingen E. Rapid and simple determination of the Escherichia coli phylogenetic groups[J].Appl Environ Microbiol, 2004,66: 4555-4558.

[6]Saira Bashir,Yasra Sarwar,Aamir Ali,et al. Multiple drug resistance patterns in various phylogenetic groups of uropathogenic E.coli isolated from Faisalabad region of Pakistan Health Biotechnology Division[J]. National Institute for Biotechnology and Genetic Engineering (NIBGE), 2008, 577:1235-1238.

[7]沈萍,魏泽庆,陈云波,等.非ICU住院患者细菌耐药性监测[J].中华医院感染学杂志,2012(3):486-490.

[8]张智洁,王军,孙继梅,等.卫生部全国细菌耐药监测网2010年东北地区细菌耐药监测[J].中国临床药理学杂志,2011(12):948-975.

StudyofPhylogeneticgroupgenesanddrugresistanceofescherichiacoli

LIRui-hua1,QUJie1,WANGNing2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116027,China;2.LaboratoryMedicineInstitute,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China)

ObjectiveTo investigate and discuss the relation between the Phylogenetic Groups and drug resistance of Escherichia coli.MethodsA total of 88 strains Escherichia Coli of ESBLs producing were collected, which were isolated from the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University. The detection of Phylogenetic Groups gene: ChuA,YjaA and TspE4.C2 is through PCR-based assays and agarose gel electrophoresis. The drug resistance is completed by Vitek2 compact automatic identification of bacterial drug resistance analysis of systems.Results88 strains E. coli isolates majority belonged to phylogenetic group D (57.95%), where as 20.45% belonged to groups A, 6.82% belong to groups B1, and 14.78% to group B2. Among the bacterial strain which come from respiratory system,group A and group D are nearly equal, but the mainly group in other systems are group D. During these Phylogenetic Groups,the drug resistance of group B2 is the highest one.ConclusionThe major phylogenetic group of Escherichia Coli is group D, then group A, B2, B1. The drug resistance of group B2 is the highest one.

Escherichia coli; Phylogenetic Groups; ChuA; YjaA; TspE4.C2

10.11724/jdmu.2013.02.18

R978.11

A

1671-7295(2013)02-0167-03

李瑞华，曲杰，王宁. 大肠埃希菌系统发育群基因检测与耐药率的研究[J].大连医科大学学报，2013,35(2)：167-169，192.

李瑞华(1972-)，女，辽宁朝阳人，副主任技师，硕士。E-mail:lrhzyp2006@163.com

2012-12-21；

2013-03-09)