油酸糖酯的酶法合成及表面性能测定

张 灏 彭冬梅 王振虎 杨奇英 沈 丹 何冰芳

(南京财经大学食品科学与工程学院应用化学系1，南京 210003)

(南京工业大学制药与生命科学学院2，南京 210009)

脂肪酸糖酯类非离子表面活性剂因其特殊的结构而呈现出独特的性能，如HLB值范围宽(为1～16)、乳化容量大，既可作为水包油(O/W)型乳化剂，又可作为油包水(W/O)型乳化剂，再加之可以由可再生资源(脂肪酸和糖类)合成，产品易完全生物降解、无毒、对皮肤无刺激及无色无味等［1－3］，这些特殊性能是其他类型的表面活性剂无法替代的，使脂肪酸糖酯类作为乳化剂在食品工业及其他领域包括化妆品，洗涤剂，口腔保健产品和医疗用品等有广泛的应用［4－7］。有报道称其抗菌、抗癌和杀虫性能，有可能开拓新市场［8－9］。本研究选择油酸和多种糖(麦芽糖、葡萄糖、山梨醇和木糖醇)在脂肪酶催化下制备油酸糖酯，并对油酸糖酯的表面性质(表面张力、HLB值、乳化性)进行了测定。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

油酸，麦芽糖，葡萄糖，山梨醇，木糖醇，丙酮，3A分子筛:国药集团化学试剂有限公司;固定化脂肪酶Novozym435:Novo公司。

79－1磁力加热搅拌器:常州国华电器有限公司;RE－52AA旋转蒸发仪:上海亚荣生化仪器厂;SHZ－CD型循环水式多用真空泵:河南巩义市英峪予华仪器厂;BS224S电子分析天平:北京赛多利斯仪器系统有限公司;VAVOVRT 360 FT－TR红外光谱仪:美国Thermo Nicolet公司;1100HPLC－MSD(SL)型液质联用仪:美国Agilent;QBZY－1全自动表面张力仪:上海方瑞仪器有限公司;FJ200－S数显高速分散均质机:上海标本模型厂;离心机:北京医用离心机厂。

1.2 试验方法

1.2.1 油酸糖酯的制备

称取一定量的油酸和糖(麦芽糖、葡萄糖、山梨醇和木糖醇)、适量溶剂丙酮和脂肪酶置于100 mL圆底烧瓶中，安装恒压滴液漏斗(装有18 g预先用无水丙酮溶剂浸泡过的3A分子筛)和回流冷凝管，搅拌下加热反应物，回流数小时后，停止加热，冷却反应液。过滤除去反应混合液中的脂肪酶，滤液用旋转蒸发仪减压蒸馏除去溶剂丙酮，得油酸糖酯粗品(油酸和油酸糖酯)。

向油酸糖酯粗品中加入一定量正己烷溶解油酸，至白色沉淀析出完全，通过离心分离得油酸糖酯，再分别用少量正己烷洗涤2次，以进一步除去少量油酸，离心分离得到纯的油酸糖酯。

1.2.2 分析

1.2.2.1 油酸转化率的测定及计算方法

反应结束后，取一定量的滤去脂肪酶的反应混合物，以1%的酚酞为指示剂，用一定浓度的NaOH标准溶液滴定未反应完的油酸，以油酸的减少量来计算转化率。

式中:m为油酸的质量/g;M油酸为油酸的相对分子质量;cNaOH为NaOH溶液的浓度/mol/L;VNaOH为滴定消耗的NaOH溶液的体积/L。

1.2.2.2 定性分析

红外测试采用KBr压片法。

质谱测试条件:离子方式:ESI+;毛细管电压:3.87 kV;锥孔电压:40 V;离子源温度:100℃;脱溶剂气温度:250℃;质量范围:200～1 200 m/z;光电倍增器电压:700 V;气体流速:4.2 L/h。

薄层色谱条件:硅胶板，展开剂为乙酸乙酯∶甲苯∶甲醇∶水 =20∶6∶3∶1(体积比)，显色剂:碘蒸气。

1.2.3 麦芽糖油酸酯的表面性质测定

1.2.3.1 表面张力的测定

根据Wilhelmy吊片法［10］，利用全自动表面张力仪测定一定浓度的淀粉糖油酸酯溶液的表面张力［11］。

1.2.3.2 HLB 值的测定

基团数法计算油酸糖酯的HLB值［13］。

水数滴定法测定油酸糖酯的HLB值［14－15］。

称取0.05 g不同HLB值的标准样品(Span 20、Span 40、Span 80、Tween 20、Tween 40 和 Tween 80)于25 mL比色管中，加入 N，N－二甲基酰胺与苯(100∶5)的混和液10 mL，保持温度为室温25℃，不断振荡比色管。用滴定管慢慢滴入蒸馏水至溶液由澄清变为混浊，记录所耗用的蒸馏水的体积。以HLB值为横坐标，蒸馏水的体积(mL)为纵坐标，制作标准曲线。

图1 Span、Tween系列乳化剂的水数标准曲线

分别称取0.05 g油酸糖酯样品于50 mL锥形瓶中，加入N，N－二甲基酰胺与苯的混和液10 mL，重复上述操作过程。记录所耗用的蒸馏水的体积，取5次平行测定的平均值，从标准曲线中查出样品的HLB值。

1.2.3.3 乳化能力及乳化稳定性的测定

采用离心法测定油酸糖酯的乳化能力及乳化稳定性［9］。

将油酸糖酯用蒸馏水配成浓度 0.01～0.5 mg/mL的溶液。分别取10.0 mL油酸糖酯溶液与5.0 mL大豆油加入到50 mL刻度试管中，恒定温度为25℃，用数显高速分散均质机以转速为13 500 r/min均质2.5 min。均质结束，记录试管中乳化层的高度(h1，mm)和乳状液的总高度(h2，mm)。乳状液静置45 min后1 100 r/min离心5 min，记录试管中乳化层的高度(h3，mm)和乳状液的总高度(h4，mm)。取5次平行测量的平均值，用公式(1)和公式(2)分别计算油酸糖酯溶液的乳化能力和乳化稳定性。

1.2.3.4 发泡能力及发泡稳定性的测定［10］

将油酸糖酯用蒸馏水分别配成浓度为0.01～0.5 mg/mL的溶液。取10.0 mL油酸糖酯溶液加入到50 mL刻度试管中，记录溶液的高度(H0，mm)后用FJ200－S数显高速分散均质机以转速为13 500 r/min均质2 min。停止均质后立即记录刻度试管中泡沫的高度(H1，mm)和溶液的高度 (H2，mm);静置45 min后再记录试管中泡沫的高度(H3，mm)。试验时环境温度保持25℃。取5次平行测量的平均值，用公式(3)和公式(4)分别计算油酸糖酯的起泡能力和泡沫稳定性。

2 结果与讨论

2.1 油酸糖酯的制备

初步试验发现，以脂肪酶Novozym435为催化剂，糖(麦芽糖、葡萄糖、山梨醇和木糖醇)与油酸发生酯化反应的影响因素主要包括原料配比、溶剂丙酮的用量、酶的用量、反应时间等。对4种糖分别进行了单因素试验，并对各因素进行了较适宜条件选择，得出如表1所示的结果。

表1 油酸与糖反应的较适宜条件及油酸的转化率

由表1可见，本试验所用糖与油酸都能在一定条件下发生酯化反应生成油酸糖酯，其中，以双糖麦芽糖与油酸反应所需的时间最长，产率也相对较低。其他单糖及糖醇与油酸反应所需时间短，油酸的酯化反应转化率也相对较高。

2.2 麦芽糖油酸酯的鉴定

分离提纯后的产品薄层色谱分析结果，如图2所示。

图2 分离提纯后的产品薄层色谱分析示意图

IR测定结果表明，产品在1730 cm－1附近出现吸收峰，归属为酯基的C O伸缩振动吸收峰，证明了羧酸酯基的存在，即油酸与糖发生了酯化反应，说明产品为油酸糖酯化合物。

MS测定结果如图3所示。

图3中为各种油酸糖酯的［M+Na］峰，其M与油酸糖酯的分子质量一致，因此可以确定所合成产物分别为油酸麦芽糖酯、油酸葡萄糖酯、油酸山梨醇酯和油酸木糖醇酯。

图3 油酸糖酯质谱图

2.3 油酸糖酯的表面性质

2.3.1 油酸糖酯的表面张力和临界胶束浓度

由图4可见，对本试验所合成的油酸糖酯进行表面张力测定结果表明:4种油酸糖酯都具有很好的降低水溶液表面张力的能力。随着乳化剂浓度的继续增加，油酸糖酯彼此靠在一起形成胶束(也称为液晶)，当达到一定的浓度时，形成稳定胶束的乳化剂(油酸糖酯)最低浓度即为临界胶束浓度(CMC)。胶束的形成有利于乳化性的提高，4种油酸糖酯的临界胶束浓度(CMC)如表2所示。mg/mL时，乳化稳定性是油酸麦芽糖酯＜油酸山梨醇酯＜油酸葡萄糖酯＜油酸木糖醇酯。

图4 油酸糖酯水溶液的浓度对表面张力的影响

表2 不同油酸糖酯的临界胶束浓度

表2的数据显示，油酸麦芽糖酯为双糖酯，其CMC低于其他3种油酸单糖酯。

2.3.2 油酸糖酯的HLB值

采用基团数法计算和水数法测定得到油酸糖酯的HLB值结果如表3。

表3 不同油酸糖酯的HLB值

表3显示，用基团数法计算和水数法测定得到的油酸糖酯的HLB值很接近，说明，实际测定和理论计算推测基本一致，化合物的HLB值取决于分子中亲水基的亲水性和亲油基的疏水性的相对强弱所决定的。HLB值的大小决定着乳化剂的使用性能，其中，油酸麦芽糖酯，因为是双糖，含有较多的极性基团(OH)，而具有较高的HLB值(＞8)，可以作O/W(水包油)型乳化剂;其他3种油酸糖酯，都为单糖酯，相对于双糖酯，它们含有较少的极性基(OH)，而具有较小的HLB值(＜8)，即主要用作W/O(油包水)型乳化剂。

2.3.3 油酸糖酯的乳化性

图5显示，4种油酸糖酯都具有很好的乳化能力，当油酸糖酯的浓度达到CMC时，油酸糖酯的乳化能力达到最高。图6显示，油酸糖酯具有一定的乳化稳定性。低浓度时，乳化稳定性都是随着浓度的增加而提高，当浓度上升到CMC浓度后，油水界面上的乳化剂不随浓度增加而增多，导致乳化性不再升高。由于乳化剂的乳化稳定性与它们和油脂的结合强度相关，结合强度越大，稳定性越好。所以，以油酸木糖醇酯的乳化稳定性相对最好，油酸麦芽糖酯虽然有较好的乳化能力，因其与油脂的结合力差而表现出乳化稳定性低于其他油酸糖酯。这一结果与它们的HLB值基本一致，即HLB值低的油酸木糖醇酯有较高的乳化稳定性，而HLB值高的油酸麦芽糖酯的乳化稳定性相对较低。当质量浓度＞0.3

3 结论

用脂肪酶催化油酸与糖(麦芽糖，葡萄糖，山梨醇和木糖醇)反应生成油酸糖酯的适宜条件为:脂肪酶的用量为0.3～0.36 g/mmol油酸，原料配比糖:油酸物质的量比为 1∶(1～1.5)，溶剂(丙酮)用量为10～20 mL/mmol油酸，回流反应42～72 h，油酸的转化率为89%～95%。

产品经红外光谱检测，在1 730 cm－1附近出现吸收峰，表明产物为酯类化合物;质谱检测显示，谱图中的［M+Na］质谱信号，所对应的M值与油酸糖酯的相对分子质量相符合，说明所得产品分别为油酸麦芽糖酯、油酸葡萄糖酯、油酸山梨醇酯和油酸木糖醇酯。

4 种油酸糖酯的 CMC 为在 7.94$10－4～3.98$10－5mol·L－1，它们都具有较强的表面活性作用;4种油酸糖酯的 HLB值6.8～13，分别可作 W/O和O/W型乳化剂;当油酸糖酯的质量浓度＞0.3 mg/mL时，乳化稳定性是油酸麦芽糖酯＜油酸山梨醇酯＜油酸葡萄糖酯＜油酸木糖醇酯。

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