10-羟基喜树碱缓释微胶囊的组织分布学研究

杨玉焕， 邵长敏， 骆沙曼， 郭宏红， 郑 健， 王 洋

(东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心，东北油田盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨150040)

喜树Camptotheca acuminata Descne是我国特有的多年生亚热带落叶阔叶树种［1］，其次生代谢产物喜树碱 (camptothecin，CPT)具有良好的抗肿瘤活性［2］。10-羟基喜树碱 (10-hydroxycamptothecin，HCPT)是将喜树碱基本环A环中10位的-H由-OH取代合成。体外和动物实验中显示HCPT比CPT有更强的抗肿瘤作用［3-5］，但是其毒副作用较大，在水中的溶解度极小，使得其临床应用受到一定的限制。基于以上两点，可将HCPT做成缓控释制剂来降低药物的不良反应。目前对HCPT研究较多的剂型是纳米粒。虽然纳米粒可以达到使HCPT缓慢释放的效果，但是载药量均低于10%［6］。

课题组前期以氯化铁 (Fe3+)和硫酸葡聚糖钠 (DS)为囊壁材料，采用聚电解质静电吸引层层自组装 (layer-by-layer self assembly，LbL)的方法制备了独特的HCPT缓释微胶囊 ［HCPT(Fe3+/DS)n］，体外释放实验结果和小鼠体内药代动力学实验结果表明，这种微胶囊载药系统与已有HCPT载药系统相比具有囊壁厚度小、包封率和载药量高、药物释放速度可控、水分散性优良等优点，是一种很有前景的药物缓释载体系统［7-8］。与注射给药相比，口服给药途径比较方便且病人的依从性比较高［9］，因而本研究以昆明小鼠为对象，研究了灌胃给药后的HCPT(Fe3+/DS)n组织分布特点，结合前期血浆药代动力学数据［7］，初步阐明了HCPT(Fe3+/DS)n的体内代谢基本规律，为HCPT(Fe3+/DS)n进一步组织靶向的深入研究提供基础，同时为更好地判断该载药系统的临床研究价值提供基础数据。

1 仪器与试药

1.1 试药 HCPT(批号:081020，纯度:99%)、CPT(批号:080510，纯度:99%)购自哈尔滨峰源高科技开发有限公司，甲醇、乙腈 (Sigma公司)，超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备 高效液相色谱系统 (Waters，USA);依利特Hypersil ODS2 C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5μm，辽宁省大连伊利特公司);WH—861漩涡混合器 (江苏省太仓市科教器材厂);Sorvall Legend Micro 17离心机 (Thermo，USA)。

1.3 实验动物 雄性小鼠 (ICR级)，体质量(20～25)g，吉林大学实验动物中心提供 ［SCXK(吉)2007-2003］。

2 方法与结果

2.1 HCPT(Fe/DS)n的制备 HCPT(Fe3+/DS)n的制备参照Guo等［7］的方法，分别制备具有4、7和10个 Fe3+/DS双层的 HCPT(Fe3+/DS)4、HCPT(Fe3+/DS)7和HCPT(Fe3+/DS)10。

2.2 色谱条件 Hypersil ODS2 C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5μm);流动相为水 (A)-乙腈(B)=80∶20;体积流量1.2 mL/min;检测器激发波长为383 nm，发射波长553 nm。

2.3 组织分布研究 给药前小鼠禁食不禁水12 h，按照80 mg/kg HCPT的剂量分别灌胃HCPT或不同层数的HCPT(Fe3+/DS)n。给药后于10 min、20 min、40 min、1 h、1.5 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h(每个时间点为3只小鼠)，处死小鼠 (脱臼法)，然后取出心、肝、脾、肺、肾、脑，用氯化钠溶液清洗表面血迹，滤纸吸尽水分，放入－20℃冰柜中保存。测定前取出组织样本，解冻，称重，加入一定量的PBS缓冲液 (质量体积比为1/2，pH 7.4)，使用十字研磨器研磨成匀浆，置－20℃冰柜冷冻保存。

2.4 生物样品的制备［10-13］取100μL组织匀浆，加入内标CPT溶液 (200 ng/mL)100μL，加入乙腈500μL，涡旋3 min蛋白沉淀。然后于高速离心机中12 000 r/min离心10 min，取上清液50μL进样。

2.5 RP-HPLC法测定各组织中HCPT的分析方法的验证

2.5.1 方法专属性 取空白组织匀浆、含HCPT标准品和内标 (CPT)的组织匀浆及给药后加入内标 (CPT)的组织匀浆按2.4项下方法操作，照2.2项下色谱条件注入色谱仪，并记录色谱图，图1给出了肝组织匀浆的代表性色谱图。结果显示，在HCPT和CPT的保留时间上没有内源性物质的干扰。

图1 肝组织匀浆色谱图Fig.1 HPLC chromatogram s of liver homogenate

2.5.2 标准曲线的绘制 以测得的药物峰面积/内标峰面积对组织匀浆药物浓度进行加权回归［14］，构建 HCPT标准曲线方程 (表1)，线性范围为2.5～80 ng/mL。结果显示，在线性范围内，各个组织的标准曲线都具有良好的线性关系 (R2＞0.993)。样品检测时，对于质量浓度超出线性范围的样品，用空白组织匀浆为基质适当稀释后再进行检测。

表1 小鼠各组织样品典型的标准曲线Tab.1 Tapical linear regression equations in different tissues

2.5.3 精密度 分别配制低、中、高3个质量浓度的HCPT质量控制 (QC)样品，按2.4项下方法制备样品，分别在同日内不同时间测定分析6次，计算日内精密度;连续5 d中同一时间点测定1次，代入标准曲线计算HCPT的质量浓度，计算日间精密度。结果表明，日内精密度在89.82%～109.41%之间，RSD% ＜10.83%;日间精密度在89.82% ～106.73%之间，RSD% ＜10.03%。

2.5.4 萃取回收率 低、中、高质量浓度QC样品按2.4项下方法制备样品，每个质量浓度重复测定6次，其结果与未经提取的HCPT/CPT进样检测获得的峰面积比值进行比较，得到萃取回收率。结果表明，平均萃取回收率为87.17%～117.69%，RSD为1.64% ～8.36%。

2.6 HCPT的组织分布 灌胃给药后，HCPT及HCPT(Fe3+/DS)n在肝、肾、脾、肺组织各个时间点均有不同程度的检出，而HCPT及HCPT(Fe3+/DS)n在心脏组织中的量均低于检测极限，在脑组织中只有HCPT(Fe3+/DS)10给药后有少量检出。根据检测结果绘制的小鼠灌胃给药HCPT和HCPT(Fe3+/DS)n后，HCPT在各个组织 (肝、肾、肺、脾、脑)中的药时曲线 (图2)。

图2 小鼠灌胃给药HCPT(Fe3+/DS)n后各组织中HCPT质量浓度与时间关系曲线Fig.2 Concentration-tim e curve of HCPT after adm inistration in different tissues

与 HCPT相比，HCPT(Fe3+/DS)n给药后，HCPT在肝组织中的药物质量浓度更高，说明HCPT(Fe3+/DS)n在肝组织中有更强的靶向蓄积效果 (图2A)。HCPT与 HCPT(Fe3+/DS)4给药组肾组织中的HCPT质量浓度没有明显的差别，而HCPT(Fe3+/DS)7和HCPT(Fe3+/DS)10给药后，HCPT在小鼠肾组织中的积累增加 (图2B)。从图2C中可以看出，小鼠灌胃给药 HCPT和 HCPT(Fe3+/DS)4后，HCPT在肺中的量一直很低，而HCPT(Fe3+/DS)7和HCPT(Fe3+/DS)10给药后，在4个小时之内肺组织中HCPT的质量浓度很高，HCPT(Fe3+/DS)10给药后，HCPT释放的速度更慢，表现出更强的缓释效果。从图2D中可以看出，与HCPT直接给药组比较，小鼠灌胃给药HCPT(Fe3+/DS)n后脾组织中HCPT质量浓度更高，说明HCPT(Fe3+/DS)n给药有利于加强药物在脾组织中的吸收。HCPT和HCPT(Fe3+/DS)n给药后，除了HCPT(Fe3+/DS)10给药组以外，其他给药组脑组织样品中均检测不到药物的存在，说明HCPT(Fe3+/DS)10增强了 HCPT在脑中的吸收，更有利于药物突破血脑屏障 (图2E)。

根据药-时数据计算HCPT在各组织中的药时曲线下面积 (AUC0－∞)，比较不同组织中AUC0－∞值的变化 (图3)。

图3 单剂量灌胃HCPT和HCPT(Fe3+/DS)n小鼠各个组织中药时曲线下的面积Fig.3 AUC0－∞ after a single oral dose of 80mg/kg in different tissues of mice

结果表明药物在各个组织中从高到低分布的顺序为肝、肾、肺、脾、脑，而心脏组织中未检出。HCPT(Fe3+/DS)10给药组在肝、肾组织中HCPT的积累接近HCPT直接给药且显著低于HCPT(Fe3+/DS)4和HCPT(Fe3+/DS)7给药组，而相对于其他给药组药物在肺、脾、脑组织中的积累则显著提高。在同一组织中，与HCPT直接给药相比较，HCPT(Fe3+/DS)n给药后HCPT的量更高。在肺、脾、脑组织中随着微胶囊层数的增多，组织中HCPT的量增加。

3 讨论

课题组利用 Fe3+和 DS为囊壁材料制备的HCPT(Fe3+/DS)n，微胶囊带有比较强的负电荷(－40 mV)，粒径大小在5～10μm。小鼠灌胃给药后的药代动力学研究显示，与HCPT直接给药相比，HCPT(Fe3+/DS)n给药后，半衰期由9.03 h延长到 25.39 h［HCPT(Fe3+/DS)7］和 30.42h［HCPT(Fe3+/DS)10］，这说明，HCPT从微胶囊中缓慢释放出来，从而延长了HCPT在血液中的滞留时间，提高了HCPT在体内的稳定性，起到了一定的缓释效果。另一方面，HCPT(Fe3+/DS)n给药后，其AUC0－∞分别提高了90% ［HCPT(Fe3+/DS)7］和96.5% ［HCPT(Fe3+/DS)10］，显著提高了HCPT的生物利用度，且与HCPT直接给药相比，HCPT(Fe3+/DS)n给药后，AUC0–24与AUC0－∞的比值有所降低，这说明，在给药后24 h内，HCPT(Fe3+/DS)n的降解速率较HCPT直接给药慢，这也在一定程度上显示了HCPT(Fe3+/DS)n的缓释效果。这与体外释放的结果是一致的，在前8个小时，微胶囊对HCPT起到了明显的缓释效果，其半衰期从0.38 h延长至1.6 h。经灌胃给药后，药物在胃肠道内缓慢的从微胶囊中释放出来被肠道吸收，进而起到了药物在动物体内缓慢释放的效果［7］。

本研究在此基础上进一步考察了HCPT(Fe3+/DS)n的组织分布特征。实验结果显示HCPT(Fe3+/DS)n给药后改变了HCPT在小鼠组织中的分布，其中肝脏的蓄积明显增强，HCPT(Fe3+/DS)4更有利于肝和肾组织中药物质量浓度的积累。在肺、脾、脑组织中随着微胶囊层数的增多HCPT在组织中的蓄积质量浓度增高。HCPT和HCPT(Fe3+/DS)n在心脏中均未检测出，说明HCPT在心脏中的分布较低，低于本实验的检测限。在脑组织中，HCPT直接给药与4～7个双层的HCPT微胶囊给药均未检测出HCPT，而在给药10个双层的HCPT微胶囊后，有少量的HCPT被检测出，这可能是因为Fe3+－DS形成的多聚物有利于冲破血脑屏障，有利于药物进入脑部，这说明为了提高脑肿瘤的治疗效果，增加HCPT(Fe3+/DS)n囊壁层数有利于药物吸收。

综合体外释放实验结果［7］，体内药代动力学和组织分布的研究结果表明，HCPT(Fe3+/DS)n具有良好的缓释效果，可有效地提高HCPT体内的吸收和分布，具有进一步深入研究的价值。

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