响应面法优化药对柴胡—黄芩的挥发油提取工艺及其化学成分GC-MS分析
2013-09-17管淑玉
罗 兰， 管淑玉
(广东药学院中药学院，广东广州510006)
药对是临床上常用的配伍形式，虽然组成相对简单，但它具有中药配伍的基本特点［1］。药对配伍的研究是复方配伍规律研究的基础和重要切入点之一，了解两药配伍后的化学成分变化，有利于剖析和阐明复方中药的配伍机理［2-4］。药对柴胡—黄芩是《伤寒论》柴胡类方中最具代表意义的基本配伍，具有疏肝解郁、清肝泄胆的功效，现代临床将它作为清泄肝胆的经典药对倍加推崇，用于肝郁气滞所致的痞积肿块等症，疗效显著。目前关于药对柴胡—黄芩配伍的研究多集中在药理作用［5-10］方面，而关于该药对配伍的化学成分报道甚少。本实验采用Box-Behnken设计原理和响应面法［11-15］确定水蒸汽蒸馏法提取药对挥发油的最佳工艺条件，利用GC-MS分析药对柴胡—黄芩配伍前后的挥发油成分，从而为阐释药对柴胡—黄芩的物质基础内涵提供实验依据。
1 仪器与材料
安捷伦7890A-5970C气质联用仪;BP211D精密天平 (德国赛多利斯);挥发油提取器;粉碎机FZ102(北京中兴伟业仪器有限公司)。
柴胡为北柴胡Bupleurum chinense DC．的干燥根 (购自广州致信中药饮片有限公司);黄芩为黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根 (购自广州致信中药饮片有限公司)。以上药材均经广东药学院中药资源系李书渊教授鉴定。药对柴胡黄芩按1∶1的剂量混合。
2 方法与结果
2.1 药对柴胡黄芩挥发油的提取方法 根据《中国药典》2010版一部附录XD，采用水蒸汽蒸馏法进行挥发油提取。
分别将柴胡、黄芩药材粉碎过筛，精密称取柴胡、黄芩药材粉末各50 g，置于同一圆底烧瓶中，加入相应倍数的水振摇混匀，浸泡，加入玻璃珠数粒，缓缓加热至沸，并保持微沸至规定时间，停止加热，放置至冷却，接收挥发油，无水硫酸钠除去挥发油中水分，精密测定挥发油体积，计算挥发油得率。
2.2 单因素试验 以挥发油得率为考察指标，采用单因素法考察提取时间、液料比、药材粒度、浸泡时间等因素对挥发油提取率的影响。
2.2.1 提取时间对挥发油得率的影响 按2.1项下的方法提取挥发油，固定液料比 (8倍)、药材粒度 (40目)、浸泡时间 (60 min)，考察不同提取时间 (4、6、8、10、12 h)对挥发油得率的影响，每个实验重复3次。结果见图1。
图1 不同提取时间对挥发油得率的影响Fig.1 Effect of extraction time on extraction rate of volatile oil
由图1可知，提取时间在4～8 h范围内，挥发油得率随着提取时间的增加而迅速提高。但在8 h后，随着提取时间的增加，挥发油得率变化很小。
2.2.2 液料比对挥发油得率的影响 按2.1项下的方法提取挥发油，固定提取时间 (8 h)、药材粒度 (40目)、浸泡时间 (60 min)，考察不同液料比 (4、6、8、10、12倍)对挥发油得率的影响，每个实验重复3次。结果见图2。
图2 不同液料比对挥发油得率的影响Fig.2 Effect of solvent/sample ratio on extraction rate of volatile oil
由图2可知，液料比在4～8倍范围内，挥发油得率随着液料比的增加而迅速提高。但在8倍以后，随着液料比的增加，挥发油得率变化很小。
2.2.3 药材粒度对挥发油得率的影响 按2.1项下的方法提取挥发油，固定提取时间 (8 h)、液料比 (8倍)、浸泡时间 (60 min)，考察药材不同粒度 (10、20、40、60、80目)对挥发油得率的影响，每个实验重复3次。结果见图3。
图3 药材不同粒度比对挥发油得率的影响Fig.3 Effect of different particle sizes on extraction rate of volatile oil
由图3可知，药材粒度在10～40目范围内，挥发油得率随着药材粉末目数的增加而迅速提高。但在40目以后，随着目数的增加，挥发油得率变化很小。
2.2.4 浸泡时间对挥发油得率的影响 按2.1项下的方法提取挥发油，固定提取时间 (8 h)、液料比 (8倍)、药材粒度 (40目)，考察不同浸泡时间 (15、30、60、90、120 min)对挥发油得率的影响，每个实验重复3次。结果见图4。
由图4可知，浸泡时间在15～60 min范围内，挥发油得率随着浸泡时间的增加而提高，但在60 min以后，随着浸泡时间的增加，挥发油得率变化很小。
2.3 响应面分析试验
图4 不同浸泡时间比对挥发油得率的影响Fig.4 Effect of different soak time on extraction rate of volatile oil
2.3.1 响应面实验设计及实验结果 根据Box-Behnken设计原理和单因素试验结果，以提取时间、液料比、药材粒度三个因素为自变量，挥发油得率为响应值，进行三因素三水平17个实验点的响应面分析试验，其中12个为析因实验，5个为中心实验。因素水平见表1，实验结果见表2。
表1 响应面分析试验的因素与水平Tab.1 Vairables and levels in response surface methodology experimental design
表2 响应面分析实验结果Tab.2 Results of response surface methodology experim ental design
2.3.2 建立模型方程与显著性检验 利用软件Design-Expert 7.0对实验结果进行多元回归拟合分析，得到挥发油得率与各因素变量的二次方程模型为 Y (%) = －0.501 15+ 0.058 462 A+0.077 775 B+0.004 501 25 C－6.25×10－5AB－1.25×10－5AC－6.25×10－6BC －2.962 5×10－3A2－4.65×10－3B2－5.587 5×10－5C2。对回归方程进行显著性检验，结果见表3。
表3 回归模型方差分析结果Tab.3 Analytic results of variance
由表3可知，提取时间和液料比的一次项均达到极显著性水平，二次项对挥发油提取的曲面效应极显著，交互项交互效应不显著，表明各影响因素对挥发油得率的影响是简单的线性关系。该二次方程模型达到极显著水平，模型的相关系数r=(8.107×10－3/8.210×10－3)×100%=98.75%，说明响应值的变化有98.75%来源于所选变量，可以用此模型对挥发油的提取效果进行分析。失拟项F值为0.41，表明失拟项相对于绝对误差不显著，而不显著的失拟项才是可取的，说明该回归方程对试验拟合情况较好，该模型能够较好的描述实验结果。
2.3.3 响应面分析 响应面图形是响应值对因素A、B、C所构成的三维空间曲面图，从响应面图上可形象地看出各参数之间的相互作用。结果见图5～7。
从图5～7的等高线形状可看出，提取时间、液料比和药材粒度相互之间的交互作用不显著。图5中沿A轴的等高线密度变化相对沿B轴的变化较大，说明提取时间对挥发油得率的影响比液料比大;图6中A轴的等高线密度变化相对沿C轴的变化较大，说明提取时间对挥发油得率的影响比药材粒度大。
图5 提取时间、液料比对挥发油得率交互影响的三维响应面图Fig.5 3D response surface p lot of extraction time，solvent/sam p le ratio and their m utual interactions on the yield of volatile oil
图6 提取时间、药材粒度对挥发油得率交互影响的三维响应面图Fig.6 3D response surface p lot of extraction tim e，particle sizes and their mutual interactions on the yield of volatile oil
2.3.4 提取条件优化 根据软件Design-Expert 7.0分析，药对挥发油的最佳提取工艺条件为提取时间9.7 h，液料比8.27倍，药材粒度38.72目，药对挥发油得率的理论值可达0.191%。为方便实验操作，将最佳提取工艺条件中的药材粒度修正为40目，实际测得的挥发油得率为0.189%，RSD为1.05%，与理论值相符，所以基于响应面法优化的提取工艺条件准确可靠。
图7 液料比、药材粒度对挥发油得率交互影响的三维响应面图Fig.7 3D response surface plot of solvent/sample ratio，particle sizes and their mutual interactions on the yield of volatile oil
2.4 药对柴胡—黄芩及各单味药材的挥发油成分GC-MS分析
2.4.1 GC-MS分析条件 DB-5MS毛细管柱 (60 m×0.32 mm，0.25μm);载气为He;进样口温度为280℃;程序升温40℃，保持5 min，2℃/min升温至240℃，保持10 min，4℃/min升温至280℃，保持10 min;离子源温度230℃，四级杆温度150℃，传输线温度280℃;谱库为wiely7n.l。
2.4.2 样品溶液的制备 按照最佳提取工艺条件，并按2.1项下的挥发油提取方法，分别提取药对柴胡—黄芩及单味药材柴胡、黄芩的挥发油，再分别精密吸取挥发油1 mL，置于100 mL量瓶中，并用乙酸乙酯稀释至刻度，混匀，即得3个样品溶液。
2.4.3 GC-MS分析结果 吸取上述3个样品溶液各1μL，进行GC-MS分析，按照面积归一化法计算相对含有量。总离子流图见图8，化学成分分析结果见表4。
由表4可知，从药对柴胡—黄芩及单味药材柴胡、黄芩的挥发油中分别鉴定了116个组分、85个组分和43个组分，分别占其挥发油总量的90.23%、91.02%和92.01%。药对挥发油主要含有脂肪酸、烷烃、萜类和芳香族化合物，在成分种类上几乎是单味药材柴胡、黄芩二者的加和，且主要来自于柴胡，表明柴胡在药对挥发油成分中占主导地位。药对挥发油中含有量较高的成分有棕榈酸(13.75%)、苯乙酮 (8.76%)、糠醛 (4.33%)、芥酸酰胺 (4.20%)、庚醛 (3.08%)亚油酸(2.37%)、壬酸 (2.31%)等。
图8 药对柴胡黄芩及单味药材柴胡、黄芩的挥发油GC-MS总离子流图Fig.8 GC-MS total ion chromatogram s of the volatile oil from Bupleurum chinense，Scutellaria b aicalensis，and their herbal pair
3 讨论
响应面法是通过对响应面等值线的分析寻求最优工艺参数，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间函数关系的一种统计方法。与正交实验相比，其优势是:在实验条件寻优过程中，可以连续的对实验的各个水平进行分析，而正交实验只能对一个个孤立的实验点进行分析。但是响应面法仍有其局限性，该方法的前提是设计的实验点应包括最佳的实验条件。本实验采用响应面法得到挥发油得率与各因素变量的二次方程模型，该二次方程模型达到极显著水平，模型的相关系数为98.75%，该回归方程对试验拟合情况较好，并确定了药对挥发油的最佳提取工艺条件为提取时间9.7 h，液料比8.27倍，药材粒度40目。
本实验采用GC-MS对药对柴胡—黄芩及单味药材柴胡、黄芩的挥发油成分进行分析，结果表明药对挥发油在成分种类上几乎是单味柴胡、黄芩二者的加和，且主要来自于柴胡，说明柴胡在药对挥发油成分中占主导地位。
表4 药对柴胡—黄芩及单味药材柴胡、黄芩挥发油的化学成分Tab.4 Chem ical com positions of volatile oil from Bupleurum chinense，Scutellaria baicalensis，and their herbal pair
续表4
［1］章巧萍．药对探析［J］．中华中医药杂志，2005，20(4):204-206．
［2］蒋永光，曹 莉，陈 颖，等．中药药对的组配形式及临床应用［J］．辽宁中医杂志，2005，32(11):1119-1120．
［3］孟祥乐，余 奇，郭 澄．中药药对的临床应用与配伍机制研究概述［J］．中国药房，2009，20(30):2394-2396．
［4］杨鸿珠，龚雨萍．中药药对的研究进展与思考［J］．中国中西医结合杂志，2010，30(2):218-220．
［5］高 琳，李庆业．柴胡-黄芩水煎液及其挥发油与黄酮类化学成分群配伍的解热比较作用研究［J］．成都中医药大学学报，2009，32(2):60-62．
［6］陈慧慧，张 敏，虞慧娟，等．柴胡和黄芩配伍解热抗炎作用研究［J］．中成药，2011，33(9):1596-1598．
［7］王宪龄，张丽萍，李连珍，等．柴胡黄芩配伍不同提取部位对扑热息痛所致小鼠急性肝损伤的保护作用［J］．中药药理与临床，2005，21(3):10-11．
［8］王宪龄，程 玲，宋 宁，等．柴胡黄芩及两者不同比例配伍抗大鼠CCl4慢性肝损伤作用的比较研究［J］．中药药理与临床，2009，25(6):70-73．
［9］王宪龄，宋 宁，崔姗姗．柴胡黄芩配伍不同提取部位抗大鼠急性酒精性肝损伤的作用机制研究［J］．中药药理与临床，2010，26(1):55-57．
［10］高 琳，谢 鸣．柴胡-黄芩合煎与分煎液的保肝作用比较［J］．中成药，2004，26(11):942-943．
［11］刘 江，樊钰虎，王泽秀，等．响应面法优化姜黄挥发油提取工艺及其化学成分研究［J］．西南师范大学学报:自然科学版，2012，37(10):70-76．
［12］徐秀泉，孙雪琴，邱晶波，等．响应面分析法优化生姜挥发油提取工艺［J］．应用化工，2011，40(6):1035-1038．
［13］刘志祥，韩 磊，曾超珍．响应面法优化微波提取苦丁茶总黄酮的工艺研究［J］．时珍国医国药，2009，20(5):1122-1124．
［14］周向军，高义霞，张 霞．响应面法优化黄花菜总黄酮提取工艺［J］．中国实验方剂学杂志，2011，17(16):29-32．
［15］汤 磊，刘 本．响应面法优化白芍中芍药苷的超临界流体提取研究［J］．中成药，2010，32(8):1332-1337．
