溶藻细菌L7的高密度培养及溶藻活性物质提纯鉴定*

杨丽丽，潘伟斌，温 勇，陈 群，3

(1.华南理工大学环境科学与工程学院，广东广州 510640;2.环境保护部华南环境科学研究所，广东广州510655;3.广东省建筑科学研究所，广东广州 510500)

随着全球水体富营养化程度的加剧，有害藻类水华的爆发日趋频繁，其造成的环境和经济等问题日益引起人们关注。目前，对藻类水华的治理主要有物理、物理化学、化学、生物等方法。物理、物理化学及化学等方法存在能耗大、投资高、对水生态系统的破坏效应大以及可能产生二次污染等问题，而生物调控在富营养化湖泊的治理中已体现出明显的效果，且具有费用低的优点，但许多成功的实例往往是短期的。

随 着 微 生 物 工 程 的 崛 起， 细 菌［1－2］、 真菌［3－4］、病毒［5］、藻类和放线菌等微生物成为调节有害藻类种群动态的重要潜在因子。其中，溶藻细菌 (algicidal bacteria)作为一种有特异性杀藻作用的微生物，具有潜在的水体富营养化治理应用价值，国内外在此领域开展了广泛的研究，研究内容主要集中在溶藻细菌的分离鉴定及其溶藻特性［6］、溶藻活性物质的分离鉴定［7］和溶藻机制［8］等方面，利用溶藻细菌治理水体虽略有报道［9］，但利用溶藻细菌开发生物杀藻剂的工程应用实例鲜有报道。

目前报道的生物杀藻剂或生物抑藻剂多从两方面制备:一是将水生植物体［10］或其它植物体［11］粉碎后提取制备;二是将具有一定杀藻或抑藻作用的单种或多种细菌菌体连同培养基等其它物质混合后制成菌剂，并直接投放到水体中使用，该菌剂多有应用报道［12］，但直接向水体中投放菌剂存在潜在的生物安全性、引入外来营养等环境风险。

可见，开发一种高效、安全、具特异性的生物活性杀藻剂并将其应用于藻类水华的应急治理具有重要意义。与直接投加富含溶藻细菌的菌剂相比，将溶藻活性物质分离提纯后制成生物杀藻剂，其生态安全性更高。

作者针对一株溶藻细菌 L7(以下简称“L7”)，从细菌高密度培养、物质提纯鉴定两方面着手，探索溶藻细菌高密度培养的工艺参数及溶藻活性物质提纯鉴定的关键技术，为生物杀藻剂的研制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 溶藻细菌

L7为研究组于2005年从广州市黄埔区某富营养化池塘水华暴发后期的水样中分离出的一株溶藻细菌［6］，该溶藻细菌对藻的作用时间短、针对性强，避免了外来微生物不适应本土富营养化水体、难以获得理想的溶藻效果、与将来工程实际应用相距甚远的弊端。L7属于蜡状芽孢杆菌 (Bacillus ce-reus)，其在 GeneBank的登录号为 DQ459876(strain L7)。

1.2 溶藻细菌培养基

L7菌种以牛肉膏蛋白胨斜面培养基［13］于4℃冷藏保存。在L7高密度培养阶段，以淀粉培养基［13］为参考培养基，考察适宜高密度培养L7的碳源、氮源、C/N质量比、初始pH值及培养条件，最终确定的细菌培养基配方及培养条件详见结论。

1.3 无菌浓缩液

取无菌滤液［14］，经旋转蒸发器65℃真空旋蒸浓缩至原体积的1/2，得2倍无菌浓缩液;相同方法制得10倍、100倍无菌浓缩液。将所得无菌浓缩液装入已高温灭菌的具塞锥形瓶中，于4℃冷藏备用。

1.4 供试藻种及藻苔制备

选用的藻种为水华鱼腥藻 (Anabaena flosaquaeFACHB－245)，来源于中国科学院水生生物研究所淡水藻种保藏中心，以BG11为培养基［15］，在温度 (23±0.5)℃，光照强度3 000 lux，光暗周期比为14 h∶10 h的条件下培养，藻液备用。

在液体BG11培养基中加入w=1.5%的琼脂条，高温灭菌。取10 mL水华鱼腥藻液，在4000 r/min下离心5 min，弃去上清液，在培养基尚处于液体状态时，将其倒入离心管，使藻液再悬浮，然后倒平板，每个平板倒15 mL，静置待其冷却凝固后获得水华鱼腥藻固体平板，即供试藻苔。将藻苔放于人工气候箱中，在与供试藻液相同的培养条件下倒置培养，藻苔备用。

1.5 仪器及试剂

本研究中选用的仪器包括:LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅，TDL-40B低速台式大容量离心机，LRH-250生化培养箱，LRH-250-GS人工气候箱，DHZ-CA大容量恒温振荡器，TU-1800SPC紫外可见分光光度计，HH-6数显恒温水浴锅，YGF300-10 L微生物发酵罐，RE-2000旋转蒸发器，Leica DME显微镜，VP32真空抽滤泵，戴安U3000液相色谱仪，Thermo Heto Ultra Freeze 3410超低温冰箱，大容量离子阱LC/MSn液相色谱—质谱联用仪等。

本研究中使用的主要试剂包括:葡聚糖凝胶Sephadex LH-20购自 GE Healthcare，甲醇 (色谱纯)购自上海凌峰化学试剂有限公司。

1.6 溶藻效果的判定

对比叶绿素a含量变化的方法 (叶绿素a去除率［9］)只适用于量大的供试液，检测量少的供试液的溶藻效果则用杯碟法。检测凝胶柱层析各洗脱组分的溶藻效果的具体方法为:取2 mL洗脱组分，80℃水浴蒸干 (目的是去甲醇，因为甲醇具有很强的杀藻能力)，灭菌后加入0.5 mL无菌水，震荡溶解，再按照杯碟法检测溶藻活性。

1.7 溶藻细菌L7的高密度培养

1.7.1 绘制L7菌液的吸光度与细菌浓度的标准工作曲线 取细菌浓度不同的10个样，用比浊法测定其在450 nm下的吸光度 (A应在0.1～1.5范围)，同时用平板菌落计数法计算其细菌数，从而得到标准工作曲线。

1.7.2 筛选适宜L7生长的碳源、氮源 以淀粉培养基为参比，以相同的量将其中的碳源 (淀粉)分别换成葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖;以相同的量将其中的氮源 〔(NH4)2SO4〕分别换成KNO3、NH4NO3、NH4Cl、尿素。将L7在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上培养24 h，每个斜面用10 mL无菌水洗脱菌苔，将菌悬液以5.4×107cfu/mL的接种量接种到200 mL含有各种不同碳源、氮源的液体培养基中，将接种后的液体培养基装入250 mL已灭菌的具塞锥形瓶，置于恒温振荡器中。以30℃恒温、100 r/min转速，振荡培养7 d，每隔12 h取15 mL样，应用比浊法测定细菌浓度。每组实验组设2个平行。

选取对L7生长具有最大促进作用的碳源、氮源作为下一步考察适宜L7生长的培养基配比、细菌接种量及培养条件的营养成分。

表1 正交实验设置表Table 1 Setup the orthogonal test

1.7.3 考察适宜L7生长的培养基配比及细菌接种量 设置3因素4水平正交实验，考察不同初始pH 值 (6.5、7.0、7.5、8.0)、细 菌 接 种 量(1.22×108、6.1×107、4.1×107、3.1×107cfu/mL)、C/N 质量比 (3∶1、4∶1、5∶1、6∶1)对 L7生长的影响。

1.7.4 考察适宜L7生长的A值及搅拌速率 利用10 L自动玻璃发酵罐，装液量6 L，除A值及搅拌速率外，培养基配方如结论所示，考察两种条件组合对L7生长的影响，这两组条件分别是A30%(±10%)+搅拌速率160(±10)r/min、A80%(±10%)+搅拌速率30(±10)r/min。

1.8 溶藻细菌L7溶藻活性物质的提纯鉴定

1.8.1 透析 将10 mL 10倍无菌浓缩液分别装入截留相对分子质量为1 000、2 000、3 500的透析袋中，将透析袋放入盛有500 mL蒸馏水的1 000 mL玻璃烧杯中，置于恒温振荡器30℃、100 r/min条件下振荡透析。透析24 h，透析期间每8 h换一次蒸馏水。透析完成后，收集透析袋内保留液，用旋转蒸发器将其浓缩至10 mL，取5 mL浓缩液稀释至20 mL，测定其溶藻效果，每组实验设2个平行。以未经任何处理的2.5倍无菌浓缩液和无菌水作为对照。

1.8.2 凝胶柱层析 经四氯化碳萃取［14］后的35 mL 100倍无菌浓缩液分装入3个34×200 mm的透析袋 (截留的相对分子质量为3 500)中，将透析袋放入装1 L蒸馏水的2 L烧杯中，置于恒温振荡器30℃、100 r/min条件下振荡透析。透析24 h，透析期间每8 h换一次蒸馏水，最终收集袋外所有的透析液。

将袋外透析液浓缩至20 mL，用一次性0.22 μm针头过滤器过滤除菌及杂质，真空冷冻干燥制得冻干粉。称取3 g冻干粉，溶于10 mL甲醇中，取甲醇溶解相过0.22 μm的微孔滤膜 (有机系)，上样2.5 mL，凝胶柱层析的洗脱剂为甲醇，洗脱速度为2 mL/min。用10 mL的比色管对洗脱组分进行逐一收集，最终共获得50个洗脱组分 (分别编号1号～50号)。

对所获得的50个洗脱组分进行紫外光谱扫描，用杯碟法检测具有特征吸收峰的洗脱组分的溶藻活性，从而筛选出具有溶藻活性的洗脱组分。

1.8.3 高效液相色谱 利用高效液相色谱分析1.8.2中所选出的有溶藻活性的洗脱组分 (7号、9号、11号、12号、14号)的物质成分分离情况，以甲醇 (AR)为空白对照。高效液相色谱的分离条件为:柱温35℃、流速1.0 mL/min、流动相v(甲醇)∶v(水)=70∶30、柱压 130 ×105Pa、进样量 10 μL。

1.8.4 液质联用 利用液相色谱—质谱联用仪，分析7号、12号洗脱组分中所含物质的相对分子质量，以甲醇 (AR)为空白对照。

2 结果与讨论

2.1 溶藻细菌L7的高密度培养

2.1.1 绘制L7菌液的吸光度与细菌浓度的标准工作曲线 L7菌液的吸光度 (A450nm)与细菌浓度的数学关系为

比浊法只适用于测定生长处于稳定期之前(包括稳定期)的菌液，同时，在测定细菌浓度的过程中要通过镜检关注细菌的生长形态，以确保培养的细菌细胞形态正常。

2.1.2 筛选适宜L7生长的碳源、氮源 在供试碳源中，当碳源为葡萄糖时，L7生长情况最好，约108 h到达稳定期，菌液最高细菌浓度为1.83×108cfu/mL，与淀粉培养基相比，能使细菌生长量提高34.86%;在供试氮源中，当氮源为氯化铵时，L7生长情况最好，约48 h后进入稳定期，菌液最高细菌浓度为1.87×108cfu/mL，与淀粉培养基相比，能使细菌生长量提高37.74%;当硫酸铵作为氮源时，对L7的生长促进作用较好，但不及氯化铵;其余供试碳源和氮源对L7生长的促进影响不显著。

2.1.3 考察适宜L7生长的培养基配比及细菌接种量 取培养第3 d的数据做正交分析，正交实验结果详见表2。影响水平为初始pH值＞C/N质量比＞接种量，三个因素的各水平都具有显著性差异(P＜0.05)，确定最适宜L7生长的条件为:初始pH值7.5、C/N质量比3∶1，细菌接种量3.1×107cfu/mL。

2.1.4 考察适宜L7生长的A值及搅拌速率A30%(±10%)+搅拌速率160(±10)r/min条件下，L7细菌浓度呈不断升高的趋势，最高可达5.30×108cfu/mL，约为初始细菌浓度的19倍。A80%(±10%)+搅拌速率30(±10)r/min条件下，L7细菌浓度最高达到1.25×108cfu/mL，且24 h后生长略呈下降趋势。由图1可知，A30%(±10%)+搅拌速率160(±10)r/min的条件较适宜L7的高密度培养。

表2 正交实验结果Table2 Results of the orthogonal test

图1 两种条件下L7菌液的A值变化Fig.1 Curves of A450nm(AU)of L7 under two different conditions

2.2 溶藻细菌L7溶藻活性物质的提纯鉴定

2.2.1 透析 经过不同规格的透析袋处理后，各透析袋内保留样加入藻液5 d后的叶绿素a含量情况见图2。2.5倍无菌浓缩液 (以下简称“原样”)的叶绿素a去除率为79.3%，截留相对分子质量分别为3 500、2 000、1 000的透析袋内的保留样的叶绿素a去除率分别为－33.7%、－49.7%、－71.7%。通过用SPSS软件进行显著性差异分析，各透析袋内保留样和原样的叶绿素a去除率都存在显著性差异 (P＜0.05)，故判断L7溶藻活性物质的相对分子质量小于1 000。

2.2.2 凝胶柱层析 凝胶柱层析的分离效果良好，9号、10号在220 nm处有吸收峰 (肩峰)，12号、13号在220、270 nm处有明显吸收峰，19号以后的洗脱组分不具强吸收峰，且峰形几乎一致。

图2 原样和各透析袋内保留样加入藻液5 d后叶绿素a含量对比Fig.2 Effect of dialysis samples on the content of Chla after 5 d

选择7号～14号作为检测溶藻活性的洗脱组分，溶藻活性检测结果见图3。7号～14号都有一定的溶藻效果，其中12号最早出现溶藻效果，11号的溶藻效果最强，无菌水无抑藻圈，无菌滤液有明显抑藻圈，可以判定7号～14号的洗脱组分都具有溶藻效果。

图3 7号～14号、无菌水 (W)、无菌滤液(F)溶藻效果对比图Fig.3 Algicidal effect of No.7～No.14，sterile water and sterile filtrate

2.2.3 高效液相色谱 7号在3.476 min处有较强吸收峰，9号在2.533 min、3.075 min处有较强吸收峰，11号在2.658 min、3.067 min处有较强吸收峰，12号在2.550 min处有较强吸收峰，14号在2.592 min处有较强吸收峰。由此推断7号、12号中的物质成分单一，而9号、11号中分别含有7号和12号不同的物质成分，14号与12号的物质成分一致。

图4 7号、12号质谱图Fig.4 Mass spectra of samples No.7 and No.12

2.2.4液质联用 7号、12号详细的质谱图见图4。由图4可知，7号内所含溶藻活性物质的相对分子质量约为588.2，12号内所含溶藻活性物质的相对分子质量约为365.0，精确相对分子质量的确定还需对这两种物质进一步提纯后应用更精密的鉴定仪器。由此可知，L7分泌的溶藻活性物质可能有两种，其相对分子质量分别约为588.2、365.0。结合图3分析，12号内所含溶藻活性物质的溶藻活性比7号内所含溶藻活性物质的溶藻活性强。

3 结论

1)在L7的高密度培养阶段，培养基配方及其培养条件:葡萄糖6 g，K2HPO41 g，NaCl 1 g，MgSO4·7H2O 1 g，NH4Cl 2 g，蒸馏水 1 L，pH 7.5，细菌接种量为3.1×107cfu/mL，A值为30%(±10%)，搅拌速率为160(±10)r/min。在此情况下，细菌生长量最高能达到5.30×108cfu/mL，约为初始细菌浓度的19倍。

2)在溶藻活性物质的提纯鉴定阶段，对四氯化碳萃取后的无菌滤液进行透析处理 (用相对分子质量为3 500的透析袋)并收集、浓缩袋外透析液，继而将样品通过Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，所获得的不同洗脱组分分别在220、270 nm处或同时在该两个波长处有紫外吸收峰，最终获得两种溶藻活性物质，其相对分子质量分别约为588.2、365.0，相较而言，相对分子质量为365.0的物质的溶藻作用更强。

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