β－葡萄糖苷酶高产菌株及其应用研究*

梁翠谊，许敬亮，袁振宏，张 宇，徐惠娟，庄新姝，高月淑，2

(1.中国科学院广州能源研究所∥中国科学院可再生能源与天然气水合物重点实验室，广东广州 510640;2.中国科学院研究生院，北京 100039）

目前，全球的纤维素年产量在1000亿t以上，是自然界中分布最广、含量最多的一类可再生性糖类资源。所以，如何充分利用好纤维素资源，已经成为世界各国关注的热点话题。利用微生物产生的纤维素酶分解纤维素成为葡萄糖和纤维二糖，再进一步转化成乙醇和丁醇等生物燃料，被认为是一种非常有潜力的纤维素高效利用策略［1］。

β－葡萄糖苷酶 (β－Glucosidase，EC 3.2.1.21)属于纤维素酶类复合组分的其中之一，能催化水解芳香基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖［2］，能有效解除纤维素酶解过程中纤维二糖对纤维素酶活性的抑制，是纤维素酶组分中的关键酶类。目前市面上的产纤维素酶木霉菌株中，β－葡萄糖苷酶含量都很低 (黑曲霉除外)，其分泌的纤维素酶中β－葡萄糖苷酶含量还不到1%，远达不到实际应用的水平［3］;再者在反应过程中，由于高温失活作用，β－葡萄糖苷酶活性会在反应过程中逐渐损失掉［4］，可利用的β－葡萄糖苷酶就更少［5］。而对于工业应用来说，酶的热稳定性越高对应用越有利［6］，近年来，耐热 (嗜热)β－葡萄糖苷酶成为纤维素酶学领域研究的热点［7］。目前对β－葡萄糖苷酶的研究主要集中在酵母、细菌和霉菌等，而其中对曲霉、康氏木霉的研究最多［8］，但少有高产、嗜温、耐乙醇的β－葡萄糖苷酶肉座菌产酶菌株报道。

本研究从武夷山常年堆放腐烂枯枝、烂叶的土壤中分离筛选得到1株高产β－葡萄糖苷酶的肉座菌Hypocrea sp.W63，对其酶学性质进行了研究，发现其具有嗜温、耐乙醇的特性，并探讨了其在汽爆秸秆同步糖化发酵产乙醇上的应用效果，以期开发该菌株的潜在用途。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 pNPG(对硝基酚 －β －D－葡萄糖苷)购自Sigma公司，实验中用到的化学试剂均为分析纯级。汽爆秸秆由中国科学院工程研究所提供，其主要组成 (w)为纤维素22.87%;半纤维素11.51%;木质素31.50%，其他成分 34.12%;纤维素酶购自和氏璧生物技术有限公司，其滤纸酶活力为880 U/g。

1.1.2 培养基

1)CMC－刚果红筛选培养基。

KH2PO40.5 g， (NH4)2SO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，纤维素粉 (微晶纤维，CMC)2.0 g，刚果红 0.2 g，琼脂18～20 g，加水补足1 L，pH值自然。

2)发酵产酶培养基。

KH2PO40.2 g， (NH4)2SO40.25 g，MgSO4·7H2O 0.03 g，CaCl20.03 g，稻秆5 g，微量元素液200 μL，加水至 100 mL。

微量元素液配方:CuSO40.1 g，MnSO40.1 g，FeSO4·7H2O 0.1 g，CoCl20.1 g，定容至 100 mL

3)同步糖化发酵培养基。

500 mL摇瓶中装反应液200 mL，气爆秸秆20 g，其中无机盐成分为 ((NH4)2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.025 g/L)，酵母膏 1.0 g/L。其余为pH 4.8的Na2HPO4－柠檬酸缓冲液。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株分离 取一定量的土壤，加入装有100 mL无菌水的摇瓶中，内加几粒玻璃珠，振荡10～20 min;取2 mL混浊液做梯度稀释，分别取10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7涂布刚果红筛选培养基和PDA培养基，30℃保温培养。挑取水解透明圈较大的单菌落在PDA培养基上纯化，纯化的菌株进行PDA斜面保存。

菌株产β－葡萄糖苷酶活力复筛:将PDA斜面保存的纯化菌株分别接种到等量的复筛发酵培养基中，30℃，120 rpm，培养72 h以上。冷冻离心取上清液粗酶液，分别用标准pNPG法测定各菌株产的β－葡萄糖苷酶粗酶活力。

1.2.2 菌株鉴定 采用改良CTAB法提取菌株总DNA，选择扩增真菌18S rDNA序列的通用引物NS1(5'－GTATCATATGCTTGTCTC－3')和NS8(5'－TCCGCAGGTTCACCTACGGA－3')对总DNA进行18S rDNA序列的扩增。送检测序，将该序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比对分析，构建系统发育树。

1.2.3 酶活力测定 对硝基苯酚 (4－nitrophenyl β－D－glucopyranoside，pNPG)作为底物，反应体系为2 mL，先将1 mL pNPG(5 mmol/L)和0.9 mL pH 5.0 Na2HPO4－柠檬酸缓冲液混匀，再加入0.1 mL适当稀释的β－葡萄糖苷酶粗酶制剂，50℃反应10 min，立即加入3 mL l mol/L的Na2CO3溶液终止反应，室温静置5 min，于400 nm处测光吸收值 (A)［9］。

酶活定义:1 min内催化产生1 μg对硝基酚的量定义为一个酶活力单位。

1.2.4 β－葡萄糖苷酶粗酶性质研究

1)温度对酶活的影响。

酶催化底物反应10 min，在40～80℃温度梯度范围内，分别测定β－葡萄糖苷酶的酶活，设最高酶活为100%;将粗酶液在40～80℃温度梯度内保温1 h，然后用标准pNPG法测定酶活，设最高酶活为100%。

2)pH值对酶活的影响。

配制不同pH值的Na2HPO4－柠檬酸缓冲液(0.1 mol/L)调节反应体系的pH值，在50℃条件下，分别在pH值为4.0～5.4条件下测定β－葡萄糖苷酶酶活，设最高酶活为100%;将粗酶液在pH值为4.0～5.4条件下放置1 h，然后用标准pNPG法测定酶活，设最高酶活为100%。

3)乙醇体积分数对酶活的影响。

在测定酶活反应体系中分别添加体积分数为5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%的乙醇，测定β－葡萄糖苷酶的酶活保留情况。以未加入乙醇处理的作为阴性对照组，设其酶活为100%。

1.2.5 β－葡萄糖苷酶粗酶同步糖化发酵应用

反应体系为:500 mL摇瓶中装反应液200 mL，该反应体系含有汽爆秸秆20 g，其中液体组分包括无机盐成分 ((NH4)2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.025 g/L)，酵母膏 1.0 g/L，其余为 pH 4.8的Na2HPO4－柠檬酸缓冲液。

向反应体系加入纤维素酶 (30 FPU/g底物)酶量，50℃预水解24 h;然后加入β－葡萄糖苷酶 (30 FPU/g底物)到反应体系中，最后按5%(体积比)接种量接种经活化的酿酒酵母至反应体系，37℃发酵，以接种酵母时计为0 h，并于0、4、8、12、24、48、96和120 h定点取样，HPLC检测乙醇生成和还原糖的减少情况。

2 结果与分析

2.1 产β－葡萄糖苷酶菌株筛选

经刚果红平板法重复筛选3次，并利用发酵产酶培养基进行发酵产酶复筛，对所产粗酶液进行β－葡萄糖苷酶酶活测定，发现其中1株菌W63具有高产β－葡萄糖苷酶活力，该菌所产β－葡萄糖苷酶的酶活可高达482.1 U/mL。

图1 肉座菌Hypocrea sp.W63的18S rDNA系统发育树Fig.1 Phylogenetic analysis of Hypocrea sp.W63 based on 18S rDNA sequence

根据真菌18S rDNA通用引物 (NS1，NS8)所获得的序列长度为1666 bp，为了确定W63的分类地位［10］，将 W63的18S rDNA序列在 NCBI上的比对分析，并结合MEGA 5.0软件构建系统发育分析，菌株W63与肉座菌属Hypocrea sp.的同源性为99%;又根据同源序列搜索，并且下载一些相关菌种的18S rDNA序列，从中挑取6个菌株的的18S rDNA进行分子系统发育树分析，结果如图1所示。结果发现，菌株W63与Hypocrea muroiana的进化距离最短，其亲缘关系也是最接近的，这与BLAST比对的结果相一致。两者的遗传距离为0.0001。序列相似性 99.8%。

图2 肉座菌Hypocrea sp.W63电镜扫描图Fig.2 Scanning electron microscopy of Hypocrea sp.W63(A:7500×;B:30000×)

形态观察发现，该菌在PDA平板上培养，培养1 d迅速长出白色菌丝，培养3 d以上开始产绿色孢子。菌丝体呈白色，菌丝小而致密，呈棉絮状，培养后期可产绿色的木霉。扫描电镜观察发现，其菌丝体成节生长，没有鞭毛，孢子呈棉絮状，附着在菌丝体上，子囊壳包埋在肉质的子座中，子座由拟薄壁组织组成 (图2)。

因此，根据18S rDNA比对分析和形态学、显微镜观察结果，将其命名为肉座菌Hypocrea sp.W63。

2.2 粗酶的最适温度及其热稳定性

一般情况下，真菌β－葡萄糖苷酶的最适作用温度在40～50℃，相比之下，真菌的嗜热β－葡萄糖苷酶最适作用温度可达55～75℃［11］。本研究发现的Hypocrea sp.W63所产的β－葡萄糖苷酶在65℃时具有最大酶促反应速度，在60℃以下能保持较长时间的稳定，60℃温浴条件下酶活能保留98.5%。当温度高于70℃时，酶蛋白快速变性，酶活迅速丧失。根据Michael W.Bauer等［12］对来自嗜热性和非嗜热性β－葡萄糖苷酶的研究认为，两者在相互演化过程中发生的酶修饰作用并不改变酶的活性中心，也不改变其专一性，只是将酶蛋白结构作部分调整以适应高温环境。通常情况下，木质纤维素酶解作用在50℃下反应24～72 h，在这期间酶活逐渐降低成为酶解反应的制约因素，β－葡萄糖苷酶的持续热稳定性能极大提高酶对生物质混合物的酶解效果［13］。

图3 温度对肉座菌Hypocrea sp.W63产的β－葡萄糖苷酶粗酶活性的影响Fig.3 Effects of temperature on crude β－glucosidase enzyme activity

该酶的最适反应温度如图3所示，目前大多数纤维素糖化反应在50℃条件下进行，将Hypocrea sp.W63所产的嗜温β－葡萄糖苷酶糖化反应温度由50℃提高到60℃，其活性可提高约20%，它可以大大提高酶糖化效率和适用范围。

2.3 粗酶的最适pH及其酸碱稳定性

测定不同pH对酶活的影响，从图4可知，该酶的pH测定范围在4.0～5.5在之间，在pH值为4.5～5.5时酶活稳定性较好，达80%以上。其最适水解pH值为4.8，且在pH为4.8时酶活稳定性最高，与大多数纤维素酶相似［14－15］，该酶属于酸性水解酶类。

图4 肉座菌Hypocrea sp.W63产的β－葡萄糖苷酶最适pH值及pH稳定性Fig.4 The optimum pH value and stability about β－glucosidase

里氏木霉T.reesei作为最常用的纤维素酶产酶菌株，很多木霉的种类与肉座菌密切相关，而肉座菌属为木霉的有性发育阶段的其中一个种属，肉座菌为木霉的有性型，两者在某个发育阶段的名称互相通用。我们研究中得到的嗜热β－葡萄糖苷酶，具有较高的酶活反应温度和pH值稳定性，昭示着该酶在用木质纤维素原料水解应用中具有较好的应用前景［16］。

2.4 乙醇体积分数对酶活力的影响

在不同体积分数乙醇情况下，乙醇体积分数对β－葡萄糖苷酶的酶活力影响结果如图5所示。低体积分数乙醇能有效提高β－葡萄糖苷酶的酶活，其中乙醇体积分数为10%时，对酶活力提高有较明显的促进效果，即使乙醇体积分数高达30%，仍然对β－葡萄糖苷酶酶活无任何抑制作用。同时，该酶在乙醇体积分数20%以下能保持较好的稳定性。综合上述研究，β－葡萄糖苷酶较强的嗜温、耐温、耐乙醇性能，尤其适合应用于木质纤维素原料的同步糖化发酵应用中。

图5 肉座菌Hypocrea sp.W63产的β－葡萄糖苷酶对乙醇的耐受性Fig.5 Ethanol tolerance about β － glucosidase

研究表明，有机溶剂对β－葡萄糖苷酶的激活是由于乙醇的存在改变了水的电势，使得β－葡萄糖苷酶具有更明显的亲核活性，从而导致更高的亲核取代反应率［17］。本研究所得的β－葡萄糖苷酶稳定性在高温和有机溶剂存在的增加，在提高现有的生物技术的应用潜力和新的可持续技术有很好的前景［18］。此外，来源不同的β－葡萄糖苷酶，其酶学性质会存在着差异。此类β－葡萄糖苷酶在非水相中不易失活，可有望用于有机合成或生物转化方面的应用，但反应介质的不同，对酶的活性及酶选择性影响很大［19］。

2.5 β－葡萄糖苷酶应用于同步糖化发酵

内切型葡聚糖酶和外切型葡聚糖酶都会受到纤维二糖的反馈抑制作用，而β－葡萄糖苷酶能够将纤维二糖降解成葡萄糖，解除纤维二糖的抑制作用［20］。纤维质原料同步糖化发酵 (SSF)是一种运用纤维素酶解产生的葡萄糖立即为酵母所发酵利用的工艺技术。但在SSF反应过程中也会随着发酵乙醇体积分数增加，进而对β－葡萄糖苷酶酶活力乃至整个酶解过程产生抑制作用［21］。而本研究获得的耐醇β－葡萄糖苷酶可以有效避开这一缺陷。

针对纤维素酶系中β－葡萄糖苷酶的相对不足，可通过基因工程手段提高β－葡萄糖苷酶的分泌量、或和某些β－葡萄糖苷酶高产菌株混合培养、或水解过程中添加外源β－葡萄糖苷酶的方法来解决，其中添加外源β－葡萄糖苷酶的工艺相对简单易行，容易在工业规模上实现［22－23］。添加外源β－葡萄糖苷酶有利于降低水解糖液中的纤维二糖含量，提高终产物葡萄糖的含量，从而提高纤维素水解得率和水解糖液中可发酵性糖的比例，从而提高终产物乙醇体积分数。本研究将筛选所得肉座菌Hypocrea sp.W63菌株产的β－葡萄糖苷酶粗酶液添加到同步糖化发酵中，结果如图6所示。研究结果表明，可发酵性总糖质量浓度明显增加，发酵所得乙醇产量明显高于阴性 (不添加外源β－葡萄糖苷酶)、阳性 (添加Sigma公司β－葡萄糖苷酶)对照反应，发酵至120 h乙醇产量最高，乙醇含量高达41.25 g/L，与阴性、阳性对照相比，乙醇产量提高近2倍。

图6 β－葡萄糖苷酶添加对同步糖化发酵效果的影响(实心曲线代表ρ(总糖)，空心曲线代表ρ(乙醇))Fig.6 Effects of adding β － glucosidase on simultaneous saccharification and fermentation

研究中采用的酶液为粗酶液，除主要有β－葡萄糖苷酶外，还含有部分纤维素内切酶、外切酶、半纤维素酶等，β－葡萄糖苷酶能有效降低水解液中纤维二糖质量浓度，提高纤维素水解得率及可发酵性糖比例，直接提升了同步糖化发酵中乙醇的产量。研究结果表明，肉座菌Hypocrea sp.W63菌株所产的β－葡萄糖苷酶性质有利于纤维素同步糖化发酵应用，有效消除终端产物纤维二糖的抑制。并且该菌株所产的β－葡萄糖苷酶酶活力较高，应用于同步糖化发酵过程具有明显的促进效果，对于加速纤维素乙醇的产业化进程具有广阔的应用前景。

3 结论

肉座菌Hypocrea sp.W63所产β－葡萄糖苷酶的酶活可高达482.1 U/mL，其β－葡萄糖苷酶最适反应温度为65℃，在60℃时有高度稳定性，最适反应pH为4.8。低体积分数乙醇能有效提高β－葡萄糖苷酶的酶活，其中乙醇体积分数为10%时，对酶活力提高有较明显的促进效果，即使乙醇体积分数高达30%，仍然对β－葡萄糖苷酶酶活无任何抑制作用。

添加本研究所得的β－葡萄糖苷酶应用于同步糖化发酵，有效消除终端产物纤维二糖的抑制，明显提高可发酵性糖比例，发酵至120 h，乙醇含量高达41.25 g/L，所得乙醇产量比阴性、阳性对照提高了近2倍。

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