负压创面治疗对烧伤创面脓毒症小鼠死亡率的影响

刘 洋，胡大海，董茂龙，白晓智，李小强

负压创面治疗(negative pressure wound therapy，NPWT)已在临床使用了20多年，大量文献表明，NPWT治疗针对创面愈合，尤其是对于复杂的难愈性创面能显著控制创面感染［1］、缩短创面愈合时间［2］。Kubiak 等［3］研究表明 NPWT 可以明显减轻腹腔脓毒症的全身炎性反应，保护脏器功能。Steven等［4］的研究表明，NPWT能降低开放性骨折创面中铜绿假单胞菌的含量，然而其作用机制还未彻底阐明。NPWT对深二度烧伤创面的早期应用，能显著降低烧伤淤滞带的范围，促进创面愈合［5-6］。本研究建立了铜绿假单胞菌感染的小鼠烫伤创面模型，观察NPWT治疗对由创面感染导致脓毒症小鼠病死率的影响，为进一步探索其相关作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级成年雄性C57小鼠108只，体质量18～20 g，8～12周龄，清洁环境饲养，由第四军医大学动物实验中心提供。

1.2 主要仪器与试剂 RNPT 1型负压治疗仪及一次性负压治疗海绵购自山西以诺医疗科技有限公司，Xenogen IVIS 200小动物活体成像系统购自美国，由美国Bio-Rad公司生产，DU@800分光光度仪由美国Beckman Coulter公司生产。细菌荧光素酶目的基因luxCDABE标记的野生型铜绿假单胞菌菌株PAO1-1ux由西北大学生命科学院段康民教授惠赠，使用前将菌株扩增培养至对数生长期，以比浊法调整菌液浓度约达(1.0×109)cfu/ml。

1.3 动物模型建立

1.3.1 烫伤动物模型建立:用3%戊巴比妥钠按40 mg/kg剂量腹腔注射行全身麻醉，背部脱毛。脱毛、用清水洗涤后擦干背部皮肤，在小鼠背部脱毛区正中部位，放置烫伤模具，开启蒸汽烫伤仪电源，将蒸汽喷头伸入圆筒，保持在距离皮肤1 cm位置，形成一个直径2 cm的Ⅲ度圆形烫伤创面，造成的烫伤深度采用病理切片证实。

1.3.2 烫伤后感染模型建立:烫伤实验当天，用体积分数3%异氟烷吸入麻醉，麻醉成功后，1 ml注射器抽取(1.0 ×109)cfu/ml铜绿假单胞菌菌液 50 μl，缓慢注射于烫伤皮下，将动物放回笼中，自然复苏，单笼饲养，自由饮食。24 h后无菌条件下，剪去烫伤痂皮，用3%过氧化氢、甲硝唑、生理盐水蘸洗创面2次。

1.4 动物分组及实验方法

1.4.1 NPWT对照实验:健康雄性 C57小鼠60只按随机数字表法分为对照组和实验组，每组30只。

按照1.3.1 和 1.3.2 项建立模型后，分别进行以下处理:实验组按创面形状剪裁医用海绵，将剪有3个侧孔的塑料引流管的一端插入海绵，另一端用贴膜将海绵固定在创面上，然后接引流瓶和负压泵，调节负压为－125 mmHg，持续负压吸引。对照组无菌生理盐水湿敷(WTD)，单层凡士林纱布覆盖创面后包扎固定。实验当天计为0 d。于0、1、3、5、7 d 5个时间点处死小鼠，每组每个时间点处死6只小鼠留取标本。

1.4.2 生存分析实验:其余48只小鼠按随机数字表法分为烫伤组、烫伤感染组、烫伤感染NPWT处理组和烫伤感染换药组，每组12只。

均按1.3.1建立烫伤模型，烫伤感染组、烫伤感染NPWT处理组和烫伤感染换药组按1.3.2建立感染模型。烫伤感染NPWT处理组给予创口持续负压吸引，烫伤感染换药组给予WTD治疗。

1.5 观察指标

1.5.1 创面细菌荧光强度检测:在实验0、1、3、5、7 d，用小动物活体成像系统检测标记菌荧光强度，发光强度单位是光子/(秒·厘米2·单位角度)。通过检测创面荧光标记菌的相对表达量，比较实验组和对照组荧光强度差异，以此来反映铜绿假单胞菌在小鼠创面的侵袭情况。

1.5.2 肺脏、肝脏、肾脏组织化学染色观察:在实验第3天收集实验组和对照组动物器官样本，进行石蜡包埋、固定。取创面上缘皮肤组织、左肺下叶、肝右叶、整个右侧肾脏为器官标本，10%福尔马林充分固定，依次进行冲洗、常温下不同浓度乙醇溶液脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片，HE染色。光镜下观察，保存图像并进行统计分析。

1.5.3 7 d生存分析:连续观察7 d，记录4组小鼠死亡时间，实验结束后进行生存分析。

1.6 统计学处理 采用SPSS 14.0统计软件进行数据整理、分析，计量资料结果以均数 ±标准差(±s)表示，两组间均数比较采用两样本 t检验。生存分析实验使用Kaplan-Meier法分析。α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 创面细菌荧光强度 实验开始时，小鼠创面标记菌的荧光表达量两组没有明显差异。1 d时对照组荧光表达量明显升高，1、3、5 d时均显著高于实验组(P＜0.01)。其中在实验第3天荧光表达量达到最大值。治疗第7天，两组细菌荧光光子计数相似。见图1、表1。

图1 两组烫伤感染小鼠创面细菌荧光强度比较与对照组比较，bP＜0.01

2.2 肺、肝、肾组织化学染色比较 在光学显微镜下观察各组组织切片，肺组织切片，对照组可见肺泡壁折叠、塌陷，炎性反应明显，有大量炎性细胞浸润，而实验组中肺组织炎性浸润明显较轻，仅少量炎性细胞浸润;肝组织切片中，实验组较对照组组织水肿轻，炎性细胞浸润少;肾组织切片中，实验组较对照组炎性细胞浸润少，组织水肿轻，肾小管坏死数量少。见图2。

表1 两组烫伤感染小鼠创面细菌荧光强度比较［±s，×108光子/(秒·厘米2·单位角度)］

表1 两组烫伤感染小鼠创面细菌荧光强度比较［±s，×108光子/(秒·厘米2·单位角度)］

注:实验组应用负压创面治疗，对照组应用无菌生理盐水湿敷。与对照组相同治疗天数比较，bP＜0.01

组别 鼠数0 d 1 d 3 d 5 d 7 d对照组 30 7.9±2.8 44.0±11.0 47.0±17.0 15.0±29.0 4.8 2.9±2.3±1.8实验组 30 11.0±6.8 2.9±2.5b 6.6±1.9b 3.9±5.6b

2.3 生存率统计分析 7 d内烫伤组全部存活，烫伤感染NPWT组生存率显著高于烫伤感染组(P＜0.05)，烫伤感染NPWT组与烫伤感染换药组生存率差异无统计学意义(P＞0.05)。前3 d烫伤感染NPWT组死亡率显著低于烫伤感染换药组(25%VS 41.7%，P ＜0.05)，见表2 和图3。

图2 两组烫伤感染3 d小鼠器官组织病理图(HE)

表2 4组烫伤小鼠7 d内死亡数及生存率(例)

图3 4组烫伤小鼠7 d内生存曲线图

3 讨论

许多资料显示NPWT作用机制可能与抑制细菌在创面组织中扩散密切相关［7］。Morykwas［8］发现NPWT能够有效地清除猪背部创面的细菌。随后，Moues［9］通过观察证明NPWT相比常规湿敷换药能有效减少创面革兰阴性菌数量。这些证据说明NPWT能够抑制某些细菌在创面增殖，但这些实验主要通过分泌物培养法来测定细菌种类，定量细菌，无法观察致病菌侵袭的范围和扩散程度，对整个创面细菌分布情况难以完整系统的了解。因此，不能充分反映NPWT对创面及深部组织细菌的抑制作用，也无法反映治疗效果。此外，NPWT清除烧伤创面的铜绿假单胞菌感染的作用也有待进一步研究。

为了解决上述问题，本研究建立了细菌荧光素酶标记的铜绿假单胞菌感染的小鼠烧伤创面模型，分别使用NPWT或WTD治疗，观察标记菌在创面扩散的情况并量化标记菌数。结果表明，NPWT治疗在早期(治疗72 h)即能显著降低标记菌的荧光光子计数，然而在实验结束时(治疗第7天)，两组细菌荧光光子计数相似。这一结果表明，NPWT在感染早期治疗效果明显优于WTD，同时WTD不能抑制铜绿假单胞菌在创面的增殖和侵袭，虽然在实验结束时两组细菌荧光光子计数相似，但结合治疗后生存率比较，使用WTD的小鼠生存率仍低于应用NPWT小鼠。此外，实验结果还提示在第1次使用NPWT后细菌荧光表达量即明显降低，然而对照组在第一次治疗后的3 d仍显著持续增加。以上结果表明，在烧伤感染早期使用NPWT能够有效减少创面组织细菌含量，这为临床使用NPWT提供了一定的借鉴价值。

7 d生存分析显示，应用NPWT和WTD治疗后，模型小鼠的死亡率分别下降到50.0%和66.7%。虽然生存率NPWT和换药组之间没有显著差异，但在小鼠死亡最快的前3 d中，死亡率统计NPWT组较对照组明显降低(25%VS 41.7%，P＜0.05)，结果提示NPWT治疗能减少铜绿假单胞菌感染创面导致的烧伤创面脓毒症的死亡率。

组织病理学检查显示NPWT组中内脏器官的炎症反应及细胞损伤低于对照组。表明NPWT在减轻体内的炎症反应和保护内脏器官方面起到了积极的作用。

综上所述，在感染创面早期使用NPWT能够快速降低创面细菌含量，缓解全身炎性失控性反应，减轻脏器损伤，降低烧伤创面脓毒症的发病率和死亡率，本研究为临床NPWT的使用提供了实验基础。在未来研究中，我们还将以此为基础，继续探索NPWT在治疗烧伤创面感染中的生物学效应及机制，为进一步合理高效的使用该技术提供理论支持和实验证据。

［1］Sheppard F R，Keiser P，Craft D W，et al.The majority of US combat casualty soft-tissue wounds are not infected or colonized upon arrival or during treatment at a continental US military medical facility［J］.The American Journal of Surgery，2010，200:489-495.

［2］Fang R，Dorlac W C，Flaherty S F，et al.Feasibility of negative pressure wound therapy during intercontinental aeromedical evacuation of combat casualties［J］.Trauma，2010，69(1):S140-145.

［3］Kubiak B D，Albert S P，Gatto L A，et al.Peritoneal negative pressure therapy prevents multiple organ injury in a chronic porcine sepsis and ischemia/reperfusion model［J］.Shock，2010，34(5):525-534.

［4］Steven J，Daniel S，Scott M，et al.Negative pressure wound therapy reduces pseudomonas wound contamination more than staphylococcus aureus［J］.Orthop Trauma，2010，24(9):598-602.

［5］Morykwas M J，David L R，Schneider A M.Use of subatmospheric pressure to prevent progression of partialthickness burns in a swine-model［J］.Burn Care Rehabil，1999，20(2):15-21.

［6］Banwell P E.The effect of topical subatmosphericpressure(TSAP)on experimental partial thickness burns［C］.Las Vegas:American Burns Association Meeting，2000.

［7］肖伟平.改良V-Y臀大肌筋膜皮瓣在骶部褥疮治疗中的应用［J］.首都医科大学学报，2012，33(4):552-553.

［8］Morykwas M J，Argenta L C，Shelton-Brown E I，et al.Vacuum-assisted closure:A new method for wound controland treatment:Animal studies and basic foundation［J］.AnnPlastSurg，1997，38(2):553-562.

［9］Moues C M，van Toorenenbergen A W，Heule F，et al.The role oftopical negative pressure in wound repair:expression of biochemicalmarkers in wound fluid during wound healing［J］.Wound Repair Regen，2008，16(4):488-494.