丝瓜籽核糖体失活蛋白基因Luffin-a原核表达载体的构建

孙晓东 王 燕 罗超 王 珺 桑 明，2▲

1.湖北医药学院基础医学研究所，湖北十堰 442000；2.武汉大学动物实验中心/ABSL-3 Lab，湖北武汉 430071

核糖体失活蛋白（RIP）是一种能够使真核细胞核糖体28s rRNA 第4 324位腺嘌呤糖苷键水解、断裂，从而使真核细胞蛋白质合成受到不可逆抑制的蛋白，广泛存在于丝瓜种子中。目前分离到的Luffin-a[1-3]、Luffin-b[4]以及新型小分子蛋白 Luffin-s[5]、Luffin-P1[6，7]均属于Ⅰ型 RIP。进年来的研究发现，RIPs 能抑制HIV 病毒在急慢性感染的淋巴细胞和单核巨噬细胞中的复制，具有抗病毒、抗肿瘤、诱导细胞凋亡等生物活性[5，8]。本实验成功构建Luffin-a的原核表达载体，对Luffin-a的体外表达做了初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌TOP10 感受态细胞和BL21（DE3）pLys表达菌株及克隆载体pGM-T均购自TIANGEN公司，原核表达载体pET-15b（+）由湖北医药学院附属人民医院临床医学研究所赠送。Trizol 购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自Promega公司，2 ×Taq PCR MasterMix、 质粒小提试剂盒、pGM-T 克隆试剂盒、DNA 纯化回收试剂盒、DNA Marker D2000、D15000、DNA MarkerⅣ、IPTG 均购自TIANGEN公司，限制性内切酶NdeⅠ和BamHⅠ购自Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 提取总RNA 及cDNA 第一链合成 用Trizol 常规提取未成熟丝瓜种子总RNA，用50 μL DEPC H2O 溶解RNA样品，紫外分光光度仪检测RNA 样品浓度与纯度，-80℃保存备用。以2 μg 总RNA 为模板，按逆转录试剂盒说明操作， 反应体系：oligdT 2 μL，10 mmol/L dNTP 1.25 μL，加入RNA 适量体积后用 DEPC H2O 补足体积至 18.5 μL，70℃反应5 min，立即插冰上；再加入逆转录酶mmlv（200 U/μL）1 μL，抑制剂 rRNasin（40 U/μL）0.5 μL，5×buffer 5 μL，使总反应体系为 25 μL，42℃反应 1 h，95℃反应 3 min 终止反应，cDNA 产物-20℃保存。

1.2.2 引物设计及Luffin-a 基因PCR 扩 增 根 据Pubmed 中检索得到的Luffin-a 核酸序列，由上海生工设计合成一对引物，在正向引物5'端引入NdeⅠ酶切位点，在互补链引物5'端引入BamHⅠ酶切位点（斜体），上下游引物之间扩增产物长760 bp。上游引物：5'-gcccatatggatgtgaggttcagtttgtc-3'；下游引物：5'-ggcggatcctcacgcaacatt ttgtttgta-3'。PCR 反应体系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，cDNA 5 μL，ddH2O 6.5 μL，94℃预变性 5 min，94℃变性 30 s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后 72℃延伸 10min；PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 PCR 产物纯化及Luffin-a表达载体的构建 根据DNA 纯化回收试剂盒说明操作将PCR 产物进行纯化，按照pGM-T 克隆试剂盒说明将Luffin-a 基因PCR 产物与pGM-T 载体连接，连接产物转化感受态细胞TOP10，通过蓝白斑筛选，挑取白色单克隆菌扩增，用质粒小提试剂盒提取重组质粒，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，重组质粒命名为pGM-T-Luffin-a，采用菌落PCR 和双酶切鉴定，再用1%琼脂糖凝胶电泳检测。将重组质粒pGM-T-Luffin-a 和原核表达载体pET-15b（+）分别进行NdeⅠ、BamHⅠ双酶切，20 μL 反应体系（NdeⅠ 1 μL、BamHⅠ 1 μL、10×buffer TangoTM2 μL、 质粒 DNA 1 μg、nuclease-free water 补足 20 μL体积），37℃反应过夜，琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的DNA条带，T4DNA 连接酶定向连接Luffin-a 和pET-15b（+），16℃反应过夜，重组质粒命名为 pET-15b（+）-Luffin-a；将连接产物转化 BL21（DE3）pLys 感受态细胞，涂 LB（ampr）平板，挑取单克隆菌划线培养，进行菌落PCR 鉴定；将正确的重组子进一步接种于含50 μg/mL 氨苄霉素的LB 培养液中，37℃振荡培养过夜，少量提取质粒，进行酶切鉴定和测序验证。

1.2.4 Luffin-a的表达及表达产物的检测 将含有正确表达载体 pET-15b（+）-Luffin-a 的转化菌 BL21（DE3）pLys接种于20 mL 含相应抗生素的LB 培养液中，37℃振荡培养过夜，按1∶100 接种至200 mL 含相应抗生素的新鲜LB培养液中，37℃振荡培养至OD600为0.6～0.7，留部分菌液做为诱导前对照，剩余部分加IPTG 至浓度为1.0 mmol/L 诱导表达6 h。分别取30 mL 菌液4℃2 000 r/min 离心15 min收集菌体，用PBS 洗涤沉淀2次，加入1 mL 裂解液悬浮沉淀，反复超声冻融至菌液变清亮，12 000 r/min 离心取上清，100℃煮沸5 min，进行PAGE 电泳检测。

2 结果

2.1 丝瓜Luffin-a 基因片段的PCR 扩增

Trizol 常规提取未成熟丝瓜种子总RNA，紫外分光光度仪检测RNA 样品A260/A280值为1.83，说明样品纯度好。PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，EB 染色后在凝胶成像系统中拍照取图，在760 bp 处有一条强荧光条带，其大小与预期片段大小一致（图1）。

图1 Luffin-a 基因RT-PCR 扩增产物电泳

2.2 Luffin-a 基因重组表达质粒的鉴定

PCR 产物切胶回收，与T 载体连接，连接产物转化感受态细胞TOP10，通过蓝白斑筛选，提取重组的克隆载体，采用菌落PCR 和双酶切鉴定，再用1%琼脂糖凝胶电泳检测（图2）。PCR 扩增产物和原核表达载体PET-15b（+）分别进行NdeⅠ、BamHⅠ双酶切，T4DNA 连接酶定向连接，16℃反应过夜；重组质粒pET-15b（+）-Luffin-a 转化 BL21（DE3）pLys 感受态细胞，涂 LB（ampr）平板，挑取单克隆菌划线培养，进行菌落PCR 鉴定（图2）。将正确的重组子接种于含氨苄霉素的LB 培养液中，37℃振荡培养过夜，少量提取质粒，进行酶切，用1%琼脂糖电泳检测（图3）。酶切结果显示，在750 bp 和5 500 bp 附近各有一条带，说明Luffin-a 已经插入表达载体pET-15b（+）。

图2 重组子的菌落PCR 鉴定

图3 Pet-15b（+）-Luffin-a 重组子的酶切结果

2.3 Luffin-a的诱导表达

将重组表达质粒pET-15b（+）-Luffin-a 转化表达感受态BL21（DE3）pLys 菌株，在含相应抗生素的LB 液体培养基中振荡培养，经IPTG 诱导6 h，在菌液以及超声上清和沉淀中均可见约27 kD的蛋白被诱导表达，与预期结果相符。不含重组表达质粒的空载体工程菌经诱导后没有出现这一条带（图4）。从而说明重组表达质粒pET-15b（+）-Luffin-a 在这一宿主菌中可表达丝瓜核糖体失活蛋白RIP。

图4 阳性重组子诱导表达

3 讨论

RIPs是一类毒蛋白，其主要酶学性质是具有RNA N-糖苷酶活力，更确切地说是多聚核苷酸∶腺苷糖苷酶活力，可特异地修饰核糖体大亚基rRNA 3'-端茎环结构的腺嘌呤残基而导致核糖体失活，阻止多肽链的延伸，从而抑制靶细胞中蛋白质合成。RIPs 不影响自身28s rRNA，但对亲缘关系较远生物的核糖体表现不同程度的损伤。核糖体失活蛋白主要存在于植物当中，特别是苦瓜、丝瓜等葫芦科植物的果实和种子中有多种核糖体失活蛋白。根据RIPs的物理特性可将其分为3 类：1型、2型和3型， 目前分离到的Luffin-a[1]、Luffin-b[4]及新型小分子蛋白 Luffin-s[8]、Luffin-P1[7，9]均属Ⅰ型RIP。作为非病原性的一类毒蛋白基因，用做抗病毒的转基因材料，Luffin 具有一定的应用前景。对丝瓜核糖体失活蛋白的研究报道较少，最先发现丝瓜种子中毒蛋白的是Kishida等[10]，他们将其命名为Luffin。1988年研究者从丝瓜籽中分离到两种单链核糖体失活蛋白Luffin-a 和 Luffin-b。在1990年和1992年相继报道Luffin-a的氨基酸序列和cDNA 序列。研究发现，丝瓜种类不同，从其种子中提取的核糖体失活蛋白的氨基酸序列也有不同，其毒性也不同[1]。目前对丝瓜核糖体失活蛋白的体外研究很少，Au等[11]发现luffin 能有效抑制HIV-1 整合酶的活性。有研究发现，RIPs 能抑制人类肿瘤细胞，同时又不杀死或很少杀死正常细胞[4-5]。

总之，丝瓜RIP 有广泛的应用前景，但仍有许多问题有待解决，如各种luffin的同源性，小分子量luffin是完全的新物质，或是某些大分子luffin的剪切产物，还是某一基因不同时期的表达产物；几种luffin的活性位点是否相同等。本研究根据报道的Luffin-a[2]核酸序列，构建其原核表达载体，体外诱导表达丝瓜核糖体失活蛋白，为进一步研究luffin的酶学性质及其抗病毒、抑制肿瘤、诱导细胞凋亡等方面的生物学活性奠定基础。

[1]Yeung H，Li W，Ng T.Isolation of a ribosome-nactivating and abortifacient protein from seeds of Luff a acutangula[J].International Journal of Peptide and Protein Research，2009，38（1）：15-19.

[2]Liu L，Wang R，He W，et al.Cloning and soluble expression of mature α-luffin from Luffa cylindrica and its antitumor activities in vitro[J].Acta biochimica et biophysica Sinica，2010，42（8）：585-592.

[3]Cui P，Yu M，Luo Z，et al.Intracellular signaling pathways involved in cell growth inhibition of human umbilical vein endothelial cells by melatonin[J].J Pineal Res，2008，44（1）：107-114.

[4]Ng TB，Lam JSY，Wong JH，et al.Differential abilities of the mushroom ribosome-inactivating proteins hypsin and velutin to perturb normal development of cultured mouse embryos[J].Toxicology in vitro，2010，24（4）：1250-1257.

[5]Ng YM，Yang Y，Sze KH，et al.Structural characterization and anti-HIV-1 activities of arginine/glutamate-rich polypeptide Luffin P1 from the seeds of sponge gourd （Luffa cylindrica） [J].Journal of Structural Biology，2011，174（1）：164-172.

[6]Wu H，Lu Q，Gao W，et al.Construction and expression of prokaryotic expression vector for recombinant immunotoxin EBI3-Luffin P1 and biological activity of expressed product[J].Chinese Journal of Biologicals，2012，3：17.

[7]Li F，Yang X，Xia H，et al.Purification and characterization of Luffin P1，aribosome-inactivatingpeptidefromtheseedsof Luffa cylindrica[J].Peptides，2003，24（6）：799-805.

[8]Wang R，Gan C，Gao W，et al.A novel recombinant immunotoxin with the smallest ribosome-inactivating protein Luffin P1：T-cell cytotoxicity and prolongation of allograft survival[J].Journal of Cellular and Molecular Medicine，2010，14（3）：578-586.

[9]刘树雷，何威，王儒鹏，等.Luffin P1-KDEL的构建、表达、纯化及鉴定[J].免疫学杂志，2010，（1）：16-20.

[10]Kishida K，Masuho Y，Hara T.Protein-synthesis inhibitory protein from seeds of Luffa cylindria roem[J].FEBS Letters，1983，153（1）：209-212.

[11]Au TK，Collins R，Lam T，et al.The plant ribosome inactivating proteins luffin and saporin are potent inhibitors of HIV-1 integrase[J].FEBS Letters，2000，471（2）：169-172.