正交试验优化固本祛风颗粒提取工艺＊

2013-09-14刘志承李曙光徐汉明曹丽萍

中国药业 2013年14期

俞冰，刘志承，李曙光，徐汉明，曹丽萍

(1.广东省深圳市中医院，广东深圳 518033; 2.广东省深圳市宝安中医院，广东深圳 518133)

固本祛风汤是深圳市中医院协定处方，由黄芪、徐长卿、苍耳子、细辛、葶苈子、甘草等12味中药组方，用于治疗过敏性鼻炎，临床应用多年，安全有效[1]，但因口感差、使用不便，患者依从性较差，影响其临床应用。为此，改进其剂型，研制了固本祛风颗粒，并对其提取工艺进行了研究。现报道如下。

1 仪器与试药

LC－20AT型高效液相色谱仪，ELSD－LTⅡ蒸发光散射检测器，CTO－10AS vp柱温箱(日本岛津公司);Sartorius BP 211D型电子天平(十万分之一，德国Sartorius公司);电热恒温套，CQ－250－DST型超声波清洗仪(250 W/40 kHz，上海生析超声仪器有限公司)。黄芪、徐长卿、苍耳子、细辛、葶苈子、甘草等药材(购自深圳市华辉药业有限公司)，经深圳市中医院药检室检验，均符合药典标准;水为超纯水，乙腈为色谱纯(美国Tedia公司);黄芪甲苷对照品(批号为110781－200512，中国药品生物制品检定所)。

2 方法与结果

2.1 黄芪甲苷含量测定

2.1.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱:GL Inertsil ODS－SP 柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈(A)－水(B)，梯度洗脱，0～12 min，A ∶B=30∶70，12～30 min，A ∶B=32∶68;流速:1 mL/min;柱温:28℃;氮气压力:360 kPa;蒸发温度:40℃。理论板数以黄芪甲苷峰计算不低于10 000。在此条件下，色谱图见图1。

2.1.2 溶液制备

精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇配制成质量浓度为0.52 g/L的对照品溶液。药材加水，按工艺提取，浓缩至100 mL，为贮备药液;精密量取贮备药液20 mL，加水饱和的正丁醇溶液振摇提取4次，每次40 mL，合并正丁醇层，用氨试液洗涤2次，每次40 mL，弃去氨试液，正丁醇层水浴浓缩至干，残渣加水10 mL，微热使溶解，通过D－101型大孔吸附树脂柱(12 cm×1.5 cm)，以水50 mL洗脱，弃去水液，再以30%乙醇30 mL洗脱，弃去洗脱液，继以70%乙醇80 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，溶液过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，作为供试品溶液。取不含黄芪的方中其他药材，按供试品溶液制备方法操作，制得阴性对照品溶液。

图1 高效液相色谱图

2.1.3 方法学考察

线性关系考察:取对照品溶液，分别精密进样 2，5，7，10，15，20 μL，按拟订的色谱条件测定峰面积，以进样量的自然对数为横坐标、峰面积积分值的自然对数为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=1.71X+11.301 5，r=0.999 8(n=6)。结果表明，黄芪甲苷进样量线性范围是 1.04 ～10.4 μg。

精密度试验:取同一对照品溶液，连续进样6次，每次10 μL，测定峰面积。结果黄芪甲苷含量的RSD为1.26%(n=6)。

稳定性试验:取同一供试品溶液，按拟订的色谱条件分别于0，2，4，6，8，12 h 时进样测定。结果含量的RSD为 1.31%(n=6)。

重复性试验:取同一贮备药液5份，分别依法制备供试品溶液并测定含量。结果贮备药液中黄芪甲苷平均含量为0.101 0 g/L，RSD为 1.58%(n=5)。

加样回收试验:精密取已知含量的贮备药液共9份，每份10mL，分别精密加含黄芪甲苷0.52 g/L的对照品溶液1，2，3 mL各3份，按供试品溶液制备方法操作，依法测定峰面积。结果见表1。

表1 黄芪甲苷加样回收试验结果(n=9)

2.2 干膏得率测定

将药液浓缩至100 mL，精密量取25 mL，置干燥至恒重的蒸发皿，浓缩至干，于105℃干燥至恒重，得干膏，按干膏质量与原药材质量的比值，求得干膏得率。

2.3 正交试验

以加水量(因素A)、提取次数(因素B)、提取时间(因素C)为考察因素进行正交试验，每个因素设3个水平，选用L9(34)正交表进行试验。结果见表2至表4。直观分析表明，各因素对提取效果的影响大小依次为提取次数、加水量、提取时间，最佳组合为C3A3B3;方差分析结果表明，因素C为显著因素，因素A、因素B为非显著因素。因此，确定最优提取工艺为C3A1B1，即每次加8倍量水煎煮1 h，提取3次。

表2 正交试验因素水平表

2.4 验证试验

取处方量药材3份，按C3A1B1提取工艺，即每次加8倍量水煎煮1 h，共提取3次。滤过，合并滤液，减压浓缩至100 mL，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件测定黄芪甲苷含量。结果贮备药液中黄芪甲苷含量分别为0.101 6，0.101 0，0.100 2 g/L，平均 0.100 9 g/L;按 2.2 项下方法测得的干膏得率分别为 22.1% ，22.3% ，22.3% ，平均 22.2% 。结果表明，按C3A1B1提取工艺，黄芪甲苷含量和出膏率均基本达到最大值，说明工艺合理可行。

3 讨论

黄芪是方中君药，具有补气升阳、益卫固表、利水消肿等功效，具有改善心功能、促进代谢、增强机体免疫、提高应激能力等作用[2]。黄芪的提取方法有超滤法、回流法、煎煮法等[3]，黄芪甲苷含量测定有高效液相色谱－紫外法(HPLC－UV)[4]、高效液相色谱－蒸光散射检测(HPLC－ELSD)法[5]、薄层扫描等方法。因HPLC－UV法对紫外末端吸收的物质灵敏度差，薄层扫描法操作烦琐、重复性差，而HPLC－ELSD法操作简单、快捷、灵敏度高，故选用HPLC－ELSD法。黄芪含黄芪皂苷和黄芪多糖等有效成分，采用水提或醇提时黄芪甲苷提取量无显著性差异，提取率能达到90% 以上[6]，而水提成本低廉，且黄芪多糖等成分水溶性较好，故采用水提工艺。选择黄芪甲苷和干膏得率为指标，可较好地保证制剂质量。